二水柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇· 2H₂O) 分析纯(AR, 99.0%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、 氯化铵(NH₄Cl)分析纯(AR, 99.5%)购自成都市科隆化学品有限公司、 对苯二胺(p-PD)购自上海麦克林生化科技股份有限公司、 氢氧化钠(NaOH)、 盐酸(HCl), Pb²⁺标准溶液(1 μ g· mL^-1)购自山东省冶金科学研究院有限公司, Zn²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Mn²⁺、 Na⁺、 Al³⁺、 Mg²⁺、 Hg²⁺、 Ca²⁺、 Cu²⁺的标准液(100 μ g· mL^-1) 均购自北京有色金属研究总院, 本实验中使用的所有试剂均为分析级, 无需进一步纯化。 在整个制备过程中使用了纯水。

美国Thermo Fishre公司Thermo Scientific Talos F200X透射电子显微镜, 美国PerkinElmer 公司LS-55荧光分光光度计, 岛津UV-3600iPlus紫外可见分光光度计, 上海耀特仪器设备有限公司DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器, 上海精密科学仪器有限公司FA2204B电子天平, 梅特勒托利多FE28pH计, 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司TG16-WS医用离心机, 武汉品冠仪器设备有限公司PGUV-10-AS超纯水机, 南京先欧仪器制造有限公司XO-5200DT超声波清洗机。

蓝色碳点 (BCDs) 制备方法参照李文婷等聚四氟乙烯反应釜水热合成方法^[20]加以改进。 称取0.4 g柠檬酸钠和2.12 g氯化铵于50 mL三颈烧瓶中, 加入20 mL纯水进行搅拌, 通入氩气后将温度逐步加热至100 ℃, 控制温度不变持续回流6 h。 将所得的淡黄色溶液BCDs冷却至室温后保存在4 ℃条件下以备后续使用。

红色碳点 (RCDs) 的制备方法如下。 称取0.216 g对苯二胺, 溶于20 mL纯水中, 倒入50 mL三颈烧瓶中磁力搅拌, 温度逐步加热至100 ℃并回流保持5 h, 待溶液冷却至室温后, 将得到的产物在10 000 r· min^-1转速下离心10 min以去除不溶性杂质, 保留上清液, 用纯水分散备用。

将制备的BCDs与RCDs以合适的体积比混合, 制成荧光强度比约2.3∶ 1的双发射比率探针溶液。 控制溶液总量不变, 分别取980 μ L比率探针溶液与20 μ L浓度0~0.5 mg· L^-1的Pb²⁺溶液超声混合均匀, 确保在1 min内扫描溶液荧光发射光谱, 设置扫描范围380~800 nm, 激发波长为360 nm。 通过计算蓝红碳点荧光强度比值来定量分析与Pb²⁺浓度的关系, 肉眼观察并记录其荧光颜色的变化。

将选取的十种常见的干扰离子Zn²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Mn²⁺、 Na⁺、 Al³⁺、 Mg²⁺、 Hg²⁺、 Ca²⁺、 Cu²⁺以Pb²⁺浓度的两倍, 即浓度为1 mg· L^-1的干扰离子分别加入比率荧光探针溶液中, 记录其荧光响应, 以离子的荧光强度比值为纵坐标考察该探针对铅离子的选择性。

对比率探针溶液在0.25、 0.5、 0.75、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 4、 5和6 h时间内进行荧光发射谱扫描, 记录其荧光响应, 同上述方法, 分析孵育时间对比率探针荧光强度的影响。

用NaOH和HCl调节去离子水的pH值, 配制Pb²⁺浓度为0.1 mg· L^-1的溶液, 将含Pb²⁺的比率探针溶液分散在等量的pH值为1~14的溶液中, 记录其荧光强度随pH值的变化趋势, 通过荧光强度比考察pH值对比率探针荧光性能的影响。

采用TEM对CDs的尺寸、 形貌等性质进行表征。 图1(a)表明制备的BCDs与RCDs纳米粒子分布均匀, 具有良好的单分散性。 BCDs颗粒呈球形, 平均直径小于10 nm, 在高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)下呈晶格条纹状[图1(a)插图]。 当Pb²⁺与BCDs-RCDs共存的情况下, 图1(b) TEM结果表明, BCDs表面官能团与Pb²⁺之间的螯合和静电相互作用^[21]导致纳米粒子聚集形成团簇, RCDs保持稳定不参与反应, 这一现象印证了蓝色荧光猝灭的原因, 图1(b)插图为HRTEM图像, 清晰地显示了BCDs的与Pb²⁺聚集形态。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 (a) BCDs和RCDs的TEM图像, 插图为BCDs的HRTEM图像; (b) BCDs-RCDs与Pb2+的TEM图像, 插图为BCDs与Pb2+聚集后的HRTEM图像Fig.1 (a) TEM images of BCDs and RCDs, Inset is the HRTEM image of BCDs; (b) TEM images of BCDs-RCDs and Pb2+, Inset is the HRTEM image after BCDs and Pb2+ aggregated

采用荧光激发光谱和荧光发射光谱分别对BCDs、 RCDs和双发射比率探针的光学性质进行表征。 图2(a)所示, 发射波长为440 nm时, BCDs的激发光谱在251和353.5 nm出现两个激发峰; 发射波长为700 nm时, RCDs激发光谱激发峰在300和360.5 nm附近。 为保证两者同时被激发, 选取360 nm作为激发波长, 图2(b)黑色曲线所示, 比率探针在440和712 nm出现两个发射峰荧光信号, 且峰宽较窄。 在365 nm手持紫光灯照射下肉眼可见明亮的蓝色荧光和红色荧光[图2(b)插图]。 两者混合后可能由于BCDs与RCDs发生了能量转移效应^[20], 导致BCDs的荧光略有降低。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 (a) BCDs与RCDs归一化的激发光谱图; (b) BCDs、 RCDs及混合溶液的荧光发射光谱(λ ex=360 nm)Fig.2 (a) Excitation spectra normalized by BCDs and RCDs; (b) Fluorescence emission spectra of BCDs, RCDs and mixed solutions (λ ex=360 nm)

整个铅离子的传感检测体系中BCDs发挥主要作用, RCDs不参与反应, 只有BCDs颗粒表面的官能团与Pb²⁺的螯合作用导致纳米粒子相互之间吸附聚集, 从而发生团聚现象导致荧光颜色发生变化, 示意图如图3所示。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 比率荧光探针Pb2+检测示意图Fig.3 Schematic diagram of ratio fluorescent probe Pb2+ detection

以目前医学应用的Pb²⁺含量范围为标准分别考察了0~0.50 mg· L^-1 Pb²⁺浓度下单个碳点与比率探针对铅离子的响应。 图4中Pb²⁺在342 nm处存在吸收峰, 与BCDs的峰值所在的位置接近, BCDs的激发光谱和Pb²⁺的紫外吸收光谱形状相似, 表明该碳点能够用于检测Pb²⁺。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 BCDs的激发光谱和Pb2+的紫外吸收光谱Fig.4 Excitation spectra of BCDs and UV absorption spectra of Pb2+

RCDs与Pb²⁺混合时不发生反应, 如图5(a)所示, 712 nm处发射峰的荧光强度在0~0.50 mg· L^-1浓度的Pb²⁺存在时几乎保持不变, 因此可以证实RCDs对Pb²⁺无响应。 BCDs表面的— COOH能够与Pb²⁺形成螯合产物, — NH₂与Pb²⁺发生络合反应使得蓝色荧光颗粒产生聚集现象, 基于内滤波效应导致荧光猝灭^[22], TEM图1(b)也能证明这一现象。 图5(b)体现了随着Pb²⁺浓度的提高, 440 nm处的发射峰的荧光强度逐渐减弱, 插图为365 nm紫光灯照射下的荧光变化情况。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 (a) RCDs的荧光发射光谱; (b) BCDs的荧光发射光谱Fig.5 (a) Fluorescence emission spectra of RCDs; (b) Fluorescence emission spectra of BCDs

根据蓝红碳点的不同体积配比设置荧光强度比I₄₄₀/I₇₁₂分别为1.3∶ 1、 1.8∶ 1和2.3∶ 1时测试不同浓度下对Pb²⁺的荧光响应, 确定两种碳点的发射峰比值为2.3∶ 1时从蓝色到紫红色的荧光颜色变化范围最宽。 将蓝红碳点基于最佳荧光强度2.3: 1均匀混合成比率荧光探针溶液, 通过荧光强度和颜色的变化来实现铅离子含量的判定。 如图6(a)为0~0.50 mg· L^-1浓度的Pb²⁺比率荧光探针的发射光谱, 插图为溶液由蓝色到红色的变化情况。 比率探针在440 nm处的荧光强度随Pb²⁺的浓度增加呈规律性递减趋势, 而712 nm处的荧光强度不受其浓度影响。 为明确比率探针荧光强度与Pb²⁺浓度的关系, 绘制440和712 nm处的峰值比值I₄₄₀/I₇₁₂与Pb²⁺浓度的关系图来评估Pb²⁺含量^[21]。 如图6(b)所示, 二者线性关系良好, R²=0.987 44, 基于三倍标准差规则, LOD=3σ /s, 其中σ 为空白探针样品测量的标准差, s为线性拟合曲线的斜率, Pb²⁺的检出限为0.013 6 mg· L^-1。 以上数据均由三组实验所得。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 (a) 比率荧光探针与Pb2+混合后的发射光谱; (b) I440/I712比值与Pb2+浓度的线性关系Fig.6 (a) Emission spectra of ratio fluorescent probe mixed with Pb2+; (b) Linear relationship between I440/I712 ratio and Pb2+ concentration

选择性是对荧光探针性能评估的一个很关键的指标, 选取了十种生活中常见的金属阳离子Zn²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Mn²⁺、 Na⁺、 Al³⁺、 Mg²⁺、 Hg²⁺、 Ca²⁺、 Cu²⁺作为干扰离子分别加入比率探针溶液中, 除Cu²⁺外未观察到干扰离子荧光比值(I₄₄₀/I₇₁₂)/(I₄₄₀/I₇₁₂)₀的明显变化(图7) , 其中(I₄₄₀/I₇₁₂)₀为无任何离子存在时的荧光强度比。 由于RCDs的碳源p-PD中氮原子的孤对电子与Cu²⁺的空轨道能形成络合物会使得712 nm处的荧光强度增大, 但在整个体系中RCDs含量极少且BCDs对Cu²⁺具有惰性, 对整个检测系统的影响微乎其微, 因此在365 nm激发下仍然表现出强烈的蓝色荧光。 干扰离子对蓝色荧光几乎没有猝灭作用, 实验表明比率探针对Pb²⁺有良好的选择性。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 比率荧光探针对其他金属离子的选择性Fig.7 Selectivity of the ratio fluorescent probe to other metal ions

以孵育时间和pH环境为变量, 利用荧光光谱法系统研究了比率荧光探针的稳定性。 图8(a)为室温下相对荧光强度随时间的变化情况, 探针的相对荧光强度在6 h内变化微小, 表明光学稳定性良好。 不同pH环境下比率探针的荧光变化情况如图8(b)所示, 在强酸和强碱环境下探针的荧光强度有很大的变化, 在pH< 3的强酸环境下, 由于BCDs表面— COOH和— NH₂与H⁺结合去质子化, 削弱了Pb²⁺的螯合作用, 导致BCDs失去稳定性, 使得蓝色荧光减弱^[23]。 在pH值为12、 13的碱性条件下, Pb²⁺与高浓度的OH— 结合形成沉淀从而减弱Pb²⁺对BCDs的猝灭反应程度, 因此荧光强度骤增。 pH值为14的强碱环境下, BCDs表面的官能团被破坏, 导致荧光减弱^[24]。 在pH值为3~11较大的范围内荧光强度比值波动不大, 实验结果表明该探针具有较好的耐盐性和耐酸性。 综合上述结果与讨论, 表明该探针的荧光稳定性良好。

图8

Fig.8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 (a) 孵育时间对比率探针性能的影响; (b)不同pH对比率探针性能的影响Fig.8 (a) Effect of incubation time on the performance of ratio probes; (b) Effect of different pH on the performance of ratio probe