PHb(BR), 含量(以N计): ≥ 15.0%, 购买自南京都莱生物技术有限公司; 葡萄糖(分析纯, AR), 天津市科密欧化学试剂有限公司生产; 儿茶素(纯度: ≥ 98.0%), 由合肥博美生物科技有限责任公司提供。

UV-2600型紫外可见分光光度计, 日本日立公司; Cary eclpise荧光分光光度计, 美国Aglient Cary elipse公司; VERTEX70型傅里叶红外光谱仪, 德国Bruker公司; EM-30Plus型电子扫描显微镜, 日本岛津公司。

1.3.1 糖基化猪血红蛋白(G-PHb)的制备

将PHb溶于适量蒸馏水中配制成3 mg· mL^-1的蛋白质溶液, 按质量比1∶ 3的比例加入葡萄糖均匀混合, 调pH至8.0左右, 在70℃条件下水浴加热2 h, 取出后立即冰浴, 于4 ℃透析24 h, 冷冻干燥即为糖基化猪血红蛋白(glycosylated porcine hemoglobin, G-PHb)。

1.3.2 CG-PHb的制备

将0.05 g的儿茶素与G-PHb溶于去离子水中, 按比例1∶ 1混合, 并将混合物溶液在室温条件下放置于磁力搅拌器上以500 r· min^-1的转速搅拌3 h, 然后于4℃透析24 h。 冷冻干燥48 h, 制得复合物微粒。

1.3.3 CG-PHb的功能特性测定

1.3.3.1 溶解度的测定

参照Nishimura等^[10]的方法, 采用双缩脲法并稍作修改。 将PHb、 G-PHb和CG-PHb溶于去离子水中, 配制成1.5 mg· mL^-1的溶液。 计算上清液中的蛋白质含量以及总蛋白质的含量, 其比值表示溶解度的大小。

1.3.3.2 浊度的测定

参照Sabow等^[11]的方法并稍作修改, 对溶液浊度进行测定。 将PHb、 G-PHb和CG-PHb用pH 8.2的Tris-HCl缓冲液稀释到2.5 mg· mL^-1, 用漩涡振荡器混合均匀2 min, 使其充分溶解, 30 min后于340 nm处比色, 测吸光度。

1.3.3.3 乳化性能的测定

根据Wang等^[12]的方法略作修改。 分别取2.5 mg· mL^-1的PHb、 G-PHb和CG-PHb溶液与大豆油(V/V为3∶ 1)均匀混合, 在10 000 r· min^-1条件下均质2 min, 制得新鲜乳化液, 于500 nm处比色, 测定其乳化活性。

1.3.3.4 表面疏水性的测定

采用溴酚蓝法测定PHb、 G-PHb和CG-PHb的表面疏水性, 于595 nm波长处比色, 表面疏水性以溴酚蓝结合量来表示。

1.3.3.5 DPPH自由基清除能力的测定

分别移取200 μ L浓度为0.1、 0.2、 0.8、 1.2、 1.6 mg· mL^-1的PHb、 G-PHb和CG-PHb与等体积的DPPH-乙醇(浓度为0.1 mmol· L^-1)至酶标板(96孔)中, 黑暗条件下静置30 min, 于517 nm处比色。

DPPH清除率(%)=1-A1-A2A0×100

式中: A₀为200 μ L DPPH-乙醇+200 μ L水, 将A₀中的200 μ L水替换为200 μ L样品测得A₁; 将A₁中的200 μ L DPPH-乙醇替换为200 μ L无水乙醇测得A₂。

1.3.4 CG-PHb的结构测定

1.3.4.1 紫外-可见光谱

在250~600 nm范围内对0.5 mg· mL^-1的PHb、 G-PHb以及制备的CG-PHb溶液进行紫外可见光谱扫描, 扫描间隔为5 nm。

1.3.4.2 荧光光谱

分别测定PHb、 G-PHb和CG-PHb在激发波长(280 nm), 激发和发射狭缝(10 nm), 扫描范围(300~400 nm)条件下的荧光光谱。

1.3.4.3 傅里叶变换红外光谱(FTIR)

将PHb、 G-PHb和CG-PHb分别与干燥后的溴化钾粉末按照1∶ 100(W/W)混匀研细后进行压片, 然后进行红外扫描分析。 用Peak Fit v4.12软件分析PHb、 G-PHb和CG-PHb酰胺I带处的蛋白质二级结构相对含量变化。

1.3.4.4 扫描电子显微镜(SEM)

分别取微量PHb、 G-PHb和CG-PHb置于样品台的导电胶上, 喷10 nm厚度的金。 通过扫描电子显微镜进行样品微观结构观察。

采用Origin 9.0软件对测得的数据进行处理及作图。 通过SPSS软件对数据进行分析, p< 0.05为差异显著。 每次试验均重复3次。

表1为PHb、 G-PHb和CG-PHb的功能特性测定结果。 由表1可以看出, CG-PHb相较于PHb溶解度升高了2.86%(p< 0.05), 但相较于G-PHb溶解度降低了3.75%(p< 0.05), 分析认为可能是G-PHb与儿茶素分子之间形成氢键, 疏水作用增大造成的。 粒子粒径的大小、 溶液颜色的深浅都能影响浊度的大小, 溶液中颗粒越大、 数量越多、 颜色越深, 浊度越大, 样品溶液浊度的大小为: CG-PHb< G-PHb< PHb。 蛋白质的乳化活性是衡量其形成水包油型乳状液能力大小的一个指标, 与蛋白质的结构及与水的亲和力有关^[13]。 CG-PHb不论在乳化性还是乳化稳定性方面都明显高于PHb和G-PHb(p< 0.05), 这是因为糖链的加入使得蛋白质溶液黏性及在水油表面的吸附层厚度增加, 与儿茶素复合后, CG-PHb的空间结构遭到破坏, 大量疏水基团暴露出来, 使溶液与油结合的面积增大、 能力提高。 另外, 通过下文对PHb、 G-PHb和CG-PHb的二级结构相对含量分析, 可以得出CG-PHb的β -折叠含量显著增加, 潘成磊等^[14]研究发现, 溶液乳化活性及稳定性的提高与猪肝水溶性蛋白中的β -折叠含量增加有关, 与本文的研究结果一致。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同处理方式PHb功能特性的变化 Table 1 PHb functional characteristics of different treatment methods 样品 溶解性/ % 浊度/ cm-1 乳化性/ (cm2· mg-1) 乳化稳定性/ % PHb 78.66± 0.31c 0.91± 0.13a 32.78± 0.36c 51.38± 0.08c G-PHb 85.27± 0.36a 0.79± 0.08b 49.83± 0.45b 63.77± 0.05b CG-PHb 81.52± 0.47b 0.68± 0.11c 71.14± 0.38a 67.46± 0.07a 注: 同列肩标字母不同表示差异显著(p< 0.05) Note: Different acronyms in the same column indicate significant differences (p< 0.05)

表1 不同处理方式PHb功能特性的变化 Table 1 PHb functional characteristics of different treatment methods

表面疏水性可以反映出蛋白质分子的变性程度和暴露在极性溶液中的疏水性氨基酸数量, PHb、 G-PHb和CG-PHb的表面疏水性变化情况如图1所示。

图1

Fig.1

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	图1 不同处理方式对PHb的表面疏水性影响Fig.1 Influence of different treatments on hydrophobicity of PHb surface

由图1可知, 经过糖基化处理和糖基化后与儿茶素复合的PHb表面疏水性显著提高(p< 0.05), 其中CG-PHb的表面疏水性最高, 为156.69%, 相较于PHb和G-PHb的表面疏水性分别增大了77.83%和50.03%(p< 0.05)。 这表明CG-PHb经糖基化反应后, 蛋白质内部折叠的结构舒展开来, 致使隐藏的疏水基团暴露增多^[15]。 当添加儿茶素时, 蛋白质氨基酸的侧链通过氢键等各种弱作用力与儿茶素的芳香环之间形成了相互作用, 蛋白质结构发生了改变, 一定程度上促进了蛋白质结构展开, 分子表面的疏水性残基暴露量升高, 从而使CG-PHb的表面疏水性增大^[16]。

DPPH清除率可以衡量一种物质在体外抗氧化能力的大小。 PHb、 G-PHb以及制备的CG-PHb的DPPH自由基清除能力变化如图2所示。

图2

Fig.2

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图2 不同处理方式对PHb的DPPH自由基清除能力的影响 注: 小写字母不同表示相同样品不同浓度差异显著(p< 0.05); 大写字母不同表示不同样品相同浓度差异显著(p< 0.05)Fig.2 Effects of different treatments on DPPH free radical scavenging ability of PHb Note: Different lowercase letters indicate significant difference in different concentrations of the sample (p< 0.05); Different capital letters indicate significant differences in the sample concentration of different samples (p< 0.05)

DPPH自由基由于其具有较高的稳定性, 而广泛地用其清除能力作为衡量物质对不稳定H原子转移为自由基的抗氧化能力大小的指标。 517 nm处的吸光度变化可以用于评价物质的自由基清除率, DPPH自由基可以与环境中的抗氧化剂所提供的氢供体反应, 使其在517 nm处的吸光度变小^[17]。 由图2可知, 经过糖基化处理和糖基化后与儿茶素复合的PHb的DPPH自由基清除能力明显提高(p< 0.05), 其抗氧化活性顺序为CG-PHb> PHb> G-PHb, 存在显著性差异(p< 0.05)。 随着浓度的增加, 三者的DPPH自由基清除能力都在不断增加, PHb、 G-PHb和CG-PHb的DPPH自由基清除率在溶液浓度为1.60 mg· mL^-1时达到最高, 分别为69.41%、 46.55%和93.60%(p< 0.05)。 与PHb、 G-PHb相比, CG-PHb具有更高的DPPH清除率, 分析认为儿茶素中的多个酚羟基被氧化, 形成相应的O-醌类, 可以提供氢原子与DPPH自由基结合, 形成稳定DPPH-H分子以清除DPPH自由基^[18]。

紫外-可见光谱可通过峰强度及峰位的变化来反映蛋白质的结构变化。

由图3可知, 蛋白质在280nm处紫外吸收高低顺序依次为: CG-PHb> PHb> G-PHb。 糖基化改性后, G-PHb在280 nm处的吸收峰明显降低, 且发生蓝移, 400 nm波长附近的吸收峰降低, 这表明蛋白质大分子中的疏水氨基酸残基所处的微环境被改变, 色氨酸、 酪氨酸等生色基团残基暴露出来, 造成G-PHb的紫外吸收减弱, 蛋白质内部展开的多肽链与葡萄糖之间形成共轭键, 致使其电子轨道能级升高, 所带的杂环π → π ^* 发生电子跃迁所需能量变大, 导致吸收带蓝移。 这与张玥等人的研究结果一致^[19]。 与儿茶素复合后, CG-PHb的紫外吸收光谱峰值增大、 峰形变宽, 最大吸收峰波长从288.5 nm红移至292 nm, 说明CG-PHb的构象发生了改变。 分析认为由于G-PHb与儿茶素形成了复合物, 两者之间相互作用, 致使蛋白质结构更加舒展, 有助于蛋白质释放出分子内部的发色基团残基中的芳香杂环, 进而使其紫外吸收强度增加。 结合位点附近发色基团所处微环境发生变化, 由极性向非极性转变, 表面疏水性增大, 王启明等研究结果也证实了这一点^[20]。

图3

Fig.3

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	图3 不同处理方式的蛋白样品的紫外-可见光谱分析Fig.3 UV spectral analysis of protein samples with different treatment methods

蛋白质中色氨酸等发色团结构与自身所处微环境的极性变化联系紧密, PHb、 G-PHb和CG-PHb的内部结构变化可通过考察其荧光强度的变化来研究。

由图4可知, PHb、 G-PHb以及CG-PHb的荧光峰对应的λ _max分别为310.21、 316.65和343.14 nm, 发生红移现象, 且荧光强度大小为CG-PHb> PHb> G-PHb。 发射峰发生位移的原因可能是由于糖基化处理后与儿茶素复合, 从而使血红蛋白分子的空间构象产生改变。 相较于未经改性的PHb, G-PHb的荧光强度明显减弱, 这可能是由于葡萄糖吸附在PHb的表面, 糖链在色氨酸残基附近形成结合位点, 导致PHb中的色氨酸荧光被屏蔽而展现受阻。 Spotti等^[21]的研究结果表明乳清蛋白与葡聚糖共价复合后, 其复合物中的发色基团残基也容易被周围区域的糖链所屏蔽, 这与本文研究结果相一致。 与儿茶素复合后, CG-PHb的荧光强度增大, 分析认为儿茶素的加入使得蛋白质的结构遭到破坏, 结构变得更加松散, 大量色氨酸暴露在溶剂中导致的。

图4

Fig.4

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	图4 不同处理方式的蛋白样品的荧光光谱分析Fig.4 Fluorescence spectrum analysis of protein samples with different treatment methods

儿茶素在与G-PHb的结合过程中降低了蛋白质分子中发射荧光物质的量子产率, 使得其荧光强度降低, 产生荧光猝灭现象。 图5显示了不同质量浓度的儿茶素与G-PHb结合的荧光光谱图。 由图5可知, 随着儿茶素浓度的增加, G-PHb在318 nm波长处的荧光强度逐渐降低, 发生荧光猝灭, 且荧光猝灭效果呈现增强趋势, 并发生红移现象。 这表明儿茶素与G-PHb之间产生了相互作用, 可能是由于G-PHb与儿茶素之间发生荧光猝灭, 蛋白质分子结构舒展, 同时儿茶素的芳香环可与G-PHb的酪氨酸残基结合, 芳香族氨基酸残基微环境的疏水性降低, 致使G-PHb的内源荧光猝灭, 在这种相互作用的促进下形成了荧光强度较低的复合物, 具体的结合特点及结合形式等作用机理将在后续试验中进一步研究。

图5

Fig.5

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	图5 儿茶素对G-PHb荧光光谱的影响 G-PHb的质量浓度为0.2 mg· mL-1; 1— 5儿茶素的浓度分别为0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5 mg· mL-1Fig.5 Effect of catechins on G-PHB fluorescence spectrum The mass concentration of G-PHb is 0.2 mg· mL-1; The mass concentrations of 1 to 5 catechins were 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg· mL-1, respectively

FTIR光谱通常用于表征化学键和官能团, 因此可以根据红外光谱图分析PHb、 G-PHb和CG-PHb的结构变化。

由图6可知, 经过不同处理后, 其酰胺Ⅰ 带(1 600~1 700 cm^-1)发生较为明显的改变, 其变化主要归因于C=O拉伸振动, N— H的弯曲和C— H的拉伸振动, 酰胺Ⅰ 带吸收峰向低频方向移动, PHb、 G-PHb以及制备的CG-PHb在3 500~3 000 cm^-1位置的峰强度差异较大。 这可能是蛋白质分子与葡萄糖共轭结合或是G-PHb与儿茶素相互作用, 分子间缔合形成氢键, 导致吸收强度增大, 进一步表明形成了复合物。

图6

Fig.6

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	图6 不同处理方式下PHb的FTIR光谱图Fig.6 FTIR spectra of PHb under different treatment methods

一般而言, α -螺旋和β -折叠都是依靠氢键维持, 通过不同的处理方法可能会改变蛋白质分子链中氢键的生成或断裂, 从而会改变α -螺旋和β -折叠的相对含量。 基于PHb的FTIR光谱, 在酰胺Ⅰ 带(1 600~1 700 cm^-1)区域分析改性对蛋白质的二级结构影响, 样品红外光谱拟合的二级结构含量如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同处理方式下PHb酰胺Ⅰ 带二级结构相对含量 Table 2 PHb amide Ⅰ band secondary structure relative content under different treatment 样品 α -螺旋/% β -折叠/% β -转角/% 无规卷曲/% PHb 17.59± 0.33b 33.65± 0.09c 33.58± 0.28a 15.18± 0.14a G-PHb 18.18± 0.40a 36.14± 0.67b 31.70± 0.60b 13.99± 0.36b CG-PHb 9.81± 1.12c 71.62± 4.93a 15.09± 3.41c 3.48± 0.42c 注: 同列肩标字母不同表示差异显著(p< 0.05) Note: Different acronyms in the same column indicate significant differences (p< 0.05)

表2 不同处理方式下PHb酰胺Ⅰ 带二级结构相对含量 Table 2 PHb amide Ⅰ band secondary structure relative content under different treatment

由表2可知, CG-PHb的二级结构发生明显变化, 其中β -折叠含量显著增加, β -折叠的形成多与分子间氢键的作用相关。 相比于PHb和G-PHb, 分别增加了37.97%和35.48%(p< 0.05), 分析认为儿茶素酚羟基与蛋白质肽羰基之间形成了氢键, 说明儿茶素与G-PHb的结合方式主要是分子间的氢键作用力。 无规卷曲等其他结构含量显著减少(p< 0.05), 说明蛋白质结构的随机性减弱, 复合物的结构更加稳定。 Li等^[22]研究结果表明, 花青素与水稻蛋白相互作用改变了其二级结构, 致使其β -折叠的含量增加, 这与本研究结果一致。

蛋白质的微观结构在一定程度上反映了其所持有的功能性质, 对PHb、 G-PHb和制备的CG-PHb进行扫描电镜分析, 结果见图7(a, b, c)。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 不同处理方式下PHb的SEM图(× 500倍) (a): PHb; (b): G-PHb; (c): CG-PHbFig.7 SEM of PHb under different treatment methods (× 500) (a): PHb; (b): G-PHb; (c): CG-PHb

由图7可知, 冷冻干燥后的PHb表面呈光滑均匀的片状结构, 添加葡萄糖进行糖基化反应后, 明显改变了其表面的微观结构, 接枝物的分子间发生大量的结合聚集现象, G-PHb呈枝状, 结构疏松、 有序, 分布均匀, 无明显的刚性结构, 与宋永令等^[23]的研究结果一致。 糖基化后的PHb与儿茶素结合后, 蛋白质表面孔洞结构增加, 蛋白质空隙增大, 进而有利于糖链嵌入其中, 有利于其功能特性的发挥, 与前文的研究结果一致。

PHb、 G-PHb和CG-PHb的功能特性与其自身内部的结构变化紧密相关。 由图8可知, PHb、 G-PHb和CG-PHb的乳化性及表面疏水性与α -螺旋结构的相对含量呈负相关, 与β -折叠结构的相关含量呈正相关, 相关系数分别为-0.87、 -0.91和0.92、 0.95, 说明样品中β -折叠结构含量越多, 样品溶液的乳化性及表面疏水性越强。 且乳化性与表面疏水性之间也存在较为明显的、 相关系数为1的正相关关系, 说明样品溶液的乳化性随表面疏水性的增强而增大。

图8

Fig.8

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	图8 PHb、 G-PHb和CG-PHb功能特性与结构变化间的相关关系Fig.8 Correlation between functional characteristics and structural changes of PHb, G-PHb and CG-PHb