茉莉花样品分别采自广西横州、 四川犍为、 福建福州、 云南元江四个产地(产地分布图见图1), 均在当地种植基地现场采购, 每个产地收集样品25批次, 共有茉莉花样品100批次, 采摘时间为2021年盛花期。 茉莉花鲜花自然风干后粉碎过60目筛, 得到浅黄色干燥粉末, 装透明塑料密封袋置于干燥器中待用。

图1

Fig.1

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	图1 茉莉花样本产地地理分布图Fig.1 Geographical distribution of Jasmine samples

i-Spec型便携式近红外光谱仪(美国必达泰克公司), 光谱采集附件: 积分球采集模块、 光纤探头采集模块, 配置InGaAs检测器; 中药粉碎机(宝利, 中国江阴); Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司), 色谱柱: Gemini-NX C18(4.6× 250 mm, 5 μ m); 所用化学计量学算法均通过Matlab R2020a(Mathworks Inc., 美国)编程实现, 在64位Windows 7.0系统下运行。

近红外光谱分析: 移取适量干燥的茉莉花花蕾粉末样品装入透明密封袋(3 cm× 4 cm), 压平样品, 厚度约5 mm, 提前将样品放置于实验室1~2 h。 实验前检查近红外分析仪器与电脑连接良好并打开光源预热30 min。 测样时先关闭光源测得暗电流作为背景信号, 再以聚四氟乙烯材质的白色底板测得参比光谱, 通过积分球(光源直径2 cm)和光纤探头测得茉莉花粉末样品的近红外漫反射光谱。 实验参数: 扫描波段900~1 700 nm, 分辨率1.5 nm, 单个样本光谱采集数据点511个, 积分球采样积分时间25 ms, 光纤探头采样积分时间2 000 ms, 扫描次数20次, 每个样本采集3次光谱, 取3次光谱信息的平均值用于数据分析。

色谱分析条件: 柱温35 ℃; 检测波长255 nm; 流动相: 0.1%甲酸水溶液和乙腈; 梯度洗脱程序: 0~3 min(5%乙腈), 3~48 min(5%~30%乙腈), 48~50 min, (30%~95%乙腈); 50~55 min(95%乙腈), 55~60 min(95%~5%乙腈); 流速1.0 mL· min^-1; 进样量10 μ L, 每个样本平行测定三次, 取3次结果的平均值用于数据分析。

近红外漫反射光谱信号容易受到背景杂散光、 样本颗粒不均匀、 仪器噪声、 基线漂移等因素的影响, 从而在光谱信息中产生部分冗余信息和干扰信息, 影响建模效果。 因此, 在建模过程中通常需要对漫反射光谱信息进行光谱预处理和波长选择, 以获取有效的光谱信息, 提高模型性能。 在本工作中, 采用Savitzky-Golay (SG)光谱平滑^[17]和多元散射校正(multivariate scatter correction, MSC)^[18]相结合进行光谱预处理。 SG平滑能有效降低噪声对光谱信号的影响, 提高信噪比, MSC能够修正漫反射光谱因粉末样品不均匀所导致的光谱信息线性变化。

主成分分析(principal component analysis, PCA)^[19]是一种常用的无监督分析技术, 通过对高维数据降维来实现数据结构可视化、 去噪等功能, 能够直观地反映出不同类别的样本之间的关系。 通过对100个茉莉花样本的近红外光谱数据(X_{100× 511})进行奇异值分解, 并对第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)进行投影分析。

线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)^[20]又称为fisher判别分析, 该方法借助于方差分析的思想将高维空间的样本投影到低维空间上, 从而使得投影后的样本数据在新的子空间上有最小的类内距离以及最大的类间距离, 通过线性判别函数和分类原则可以对新样本的类别归属进行预测。 K近邻法(k-nearest neighbor, KNN)^[21]是一种常用的机器学习算法, 属于有监督模式识别分析。 KNN的核心思想是对于一个给定的训练集, 当需要对新样本进行预测时, 在训练集中找到与待预测样本最邻近的k个样本, 并根据这k个样本的多数类别标签对带预测样本进行分类。 本工作中, 首先利用PCA对近红外光谱数据矩阵进行主成分分解, 再取若干主成分作为LDA和KNN的输入变量。

不同产地茉莉花样品的近红外漫反射原始光谱如图2(a)和(b)所示, 光谱轮廓呈现一致性, 均在1 050、 1 200、 1 450和1 550 nm附近有明显的吸收峰, 主要为茉莉花蕾中有机物的C— H, N— H, O— H等含氢基团的倍频峰, 包括O— H二级倍频(950 nm)、 C— H二级倍频(1 200 nm)、 O— H一级倍频(1 450 nm)、 — CH₃与— CH₂合频(1 360~1 390 nm)等。 比较发现, 积分球和光纤探头所采集的光谱在整体上呈现相似的光谱特征, 但积分球采集信号的信噪比较高, 光谱更加平滑, 光纤探头采集信号的信噪比较低, 光谱呈现明显的噪音信号干扰, 在光谱两端尤为严重。 结合SG和MSC两种光谱预处理方法对近红外光谱进行处理可以有效地降低噪音及颗粒散射引起的背景干扰, 预处理后的光谱图如图2(c)和(d)所示。 由于近红外光谱是弱信号, 同时峰宽较大, 谱峰重叠严重, 因此不同产地茉莉花的光谱信息差异较小, 无法直接从漫反射光谱图中找出特异性信息来实现产地识别, 必须借助化学计量学技术来解析不同产地茉莉花的近红外光谱信息间的区别。

图2

Fig.2

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图2 茉莉花粉末样品的近红外光谱图 (a): 积分球采集的原始光谱; (b): 光纤探头采集的原始光谱; (c): 经SG-MSC预处理后的积分球采集的原始光谱; (d): 经SG-MSC预处理后的光纤探头采集的原始光谱Fig.2 NIR spectra of jasmine powder samples (a): Raw spectra collected by integrating sphere; (b): Raw spectra collected by optical fiber probe; (c): Raw spectra collected by integrating sphere after SG-MSC pre-processing; (d): Raw spectra collected by optical fiber probe after SG-MSC pre-processing

为揭示不同产地茉莉花在近红外漫反射光谱信息上的潜在差异, 首先对茉莉花样本的近红外漫反射光谱数据进行主成分分析, 并在PC1和PC2上进行投影分析, 结果如图3所示。 由图3(a)可见, 通过积分球采样得到的近红外光谱数据能够对四个不同产地的茉莉花进行较好的组内聚集和组间分散, 聚类效果良好。 方差分析结果表明, PC1能解释63.50%的信息量, PC2能解释33.48%的信息量。 但是, 当采用光纤探头进行信号采集时, 所得光谱数据的聚类效果显著下降, 尤其是福建和云南两地的茉莉花样本存在严重重叠, 无法区分[图3(b)]。 方差分析结果表明, PC1能解释82.67%的信息量, PC2能解释14.92%的信息量。 其原因在于光纤探头采样所得光谱的信噪比较低, 光谱信息量不如积分球采样, 从而需要进行进一步的光谱预处理以提高信噪比。 因此, 采用了SG平滑技术结合MSC校正方法对原始光谱数据进行预处理, 对预处理后的光谱数据进行主成分分析的结果如图3(c)和(d)所示。 由图可见, 经过预处理后, 积分球采样数据和光纤探头采样数据的主成分分析聚类效果都有明显提升, 尤其是对于光纤探头采样数据, 福建和云南两地的茉莉花样本从严重重叠到完全区分。 结果表明, SG平滑技术结合MSC校正方法能够有效地提高光谱信噪比, 后续建模数据均采用SG-MSC预处理后的光谱数据。

图3

Fig.3

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图3 主成分分析投影图 (a): 积分球采集的原始光谱PCA分析结果; (b): 光纤探头采集的原始光谱PCA分析结果; (c): 经SG-MSC预处理后的积分球采集的原始光谱PCA分析结果; (d): 经SG-MSC预处理后的光纤探头采集的原始光谱PCA分析结果Fig.3 Principal component analysis projection diagram (a): PCA analysis of raw spectra collected by integrating sphere; (b): PCA analysis of raw spectra collected by optical fiber probe; (c): PCA analysis of raw spectra collected by integrating spheres after SG-MSC pre-processing; (d): PCA analysis of raw spectra collected by optical fiber probe after SG-MSC pre-processing

主成分分析是一种无监督分析方法, 没有利用到样本的标记信息。 为建立准确的产地识别模型, 下面采取两种有监督分析方法: K近邻法和偏最小二乘判别分析。 在建立模型之前, 从每个产地的茉莉花样本中随机选取17个样本, 共得到68个样本作为训练集, 剩余的32个作为测试集。 训练集用于建立模型, 测试集用于评估模型的预测能力。 在利用训练集建立模型的过程中, 通过交互检验进行参数优化以获得最优的模型性能。

2.3.1 线性判别分析

采用Fisher线性判别分析法对训练集中的68个样本建立判别模型, 由于近红外光谱数据存在的共线性问题会导致极大的计算误差, 因此首先对近红外光谱数据矩阵进行主成分分解, 再取若干主成分作为线性判别分析的输入变量。 结果表明, 对于积分球采集的近红外数据, F1和F2解释的累积方差达到总方差的98.71%, 当主成分数大于3时线性判别分析即可获得100%的分类预测准确率。 如图4(a)所示, 当训练集和测试集中的样本投影到前2个判别函数(F1和F2)构成的二维空间时, 训练集中的68个样本呈现明显的分类聚集特征, 测试集中的32个样本也均能投影在相同产地的训练样本区域。 对于光纤探头采集的近红外数据, F1和F2解释的累积方差达到总方差的89.69%, PCA-LDA投影分析如图4(b)所示。 由图4(a)和(b)对比可见, 由于光纤探头采集的光谱数据信噪比(S/N)比积分球低, 在相同参数下建立得到的判别模型分类效果有所降低, 样本更加分散。 尽管如此, 基于光纤探头数据建立的PCA-LDA模型仍然对测试集中的32个样本有100%的预测准确率。

图4

Fig.4

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	图4 四个不同产地茉莉花样本的PCA-LDA投影分析图 (a): 积分球采集光谱数据; (b): 光纤探头采集光谱数据; ☆训练样本; ●测试样本; 主成分数=3Fig.4 PCA-LDA projection analysis of jasmine samples from four different origins (a): Integrating sphere acquisition; (b): Optical fiber probe acquisition; ☆Training sample; ●test samples; The number of principal components=3

2.3.2 K近邻法

在K近邻法中, 同样以经主成分分解后的光谱数据的若干个主成分作为输入数据进行建模, 以标准欧氏距离作为距离参数。 通过留一法交互检验对主成分数(PCs)和近邻数(k)进行参数优化, 结果如图5所示。 结果表明, 在3~5个主成分数以及1~9个近邻数的模型空间中均能获得高预测准确率, 从模型简洁性和计算效率考虑, 设定主成分个数为3, 近邻数为1。 利用建立的KNN模型对测试集中的32个样本进行预测, 积分球光谱数据的预测准确率为100%, 光纤探头光谱数据的预测准确率为93.75%。

图5

Fig.5

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	图5 留一法交互检验参数(PCs和k)优化结果示意图Fig.5 Optimization result of the leave-one-out cross-validation (PCs and k)

近红外光谱反映的是样本中所有有机化合物含氢基团的分子振动信息, 尽管通过整个光谱的差异能够实现样本的识别, 但无法直观反映样本的组分差异。 为进一步揭示不同产地茉莉花样本的化学组成差异, 本研究通过测定了不同产地茉莉花花蕾样本的液相色谱(图6)。 通过总离子流图对比分析可以看出不同产地的茉莉花样本具有相同的整体相似特性, 这是由其固有的植物种属特征决定的, 但是由于生长环境的影响, 其色谱指纹图谱依然在含量分布及局部特征物质方面呈现出差异性, 相似度评价结果表明四个产地的茉莉花样本相似性在0.868 6~0.969 4之间。 这种化学组成定性定量的差异进一步影响了样本的近红外光谱特征, 进而奠定了基于近红外光谱实现产地识别的物质基础。

图6

Fig.6

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	图6 不同产地茉莉花提取液的色谱总离子流图Fig.6 Total ion flow chromatograms of jasmine extracting salutions of different origins