DSAZn与槲皮素的配位结合及对槲皮素的高灵敏度检测
翟艳珂1, 潘宜杏1, 向浩1, 徐黎1,*, 朱泽策2, 雷咪1
1. 湖北中医药大学药学院, 湖北 武汉 430072
2. 武汉纺织大学化学与化工学院, 湖北 武汉 430200
*通讯作者 e-mail: xuli81819009@126.com

作者简介: 翟艳珂,女, 2001年生,湖北中医药大学药学院本科生 e-mail: 2742429420@qq.com

摘要

槲皮素为天然黄酮类化合物, 可用于高血压、 高血脂、 心血管疾病、 癌症等的预防和治疗; 槲皮素的定量检测在生物化学、 临床医学等领域尤为重要。 利用分子荧光物质(DSAZn)的聚集诱导发光现象(AIE), 通过配位作用识别靶标分子槲皮素, 结合激发态电子转移原理, 提出了一种AIE型荧光分子对槲皮素的高灵敏度、 高选择性检测方法。 实验研究了pH 7.0的PBS缓冲液中DSAZn的荧光随着五种药物分子(槲皮素、 淫羊藿素、 异鼠李素、 芦丁、 多巴胺)加入后的变化情况。 采用荧光分光光度计, 以415 nm为激发波长, 扫描435~680 nm的荧光发射光谱。 采用紫外分光光度计, 扫描DSAZn 250~750 nm的紫外吸收光谱。 紫外检测表明中药分子槲皮素可以与AIE荧光探针形成复合物, 因此加入槲皮素后AIE探针的荧光被静态猝灭。 荧光检测表明五种药物分子对荧光探针的猝灭强弱有明显差异, 槲皮素与DSAZn结合常数为1.34×107 L·mol-1, 比其他四种药物分子和DSAZn的结合常数高出一个数量级, 显示出DSAZn对槲皮素具有较好的选择性。 槲皮素的检测限为3.07 nmol·L-1, 低于诸多文献已报道的参考值, 表明DSAZn对槲皮素的识别具有较高的灵敏度。 由荧光滴定光谱和荧光滴定曲线得到槲皮素对DSAZn的滴定方程为: y=0.013 4 x-0.294 82, 槲皮素浓度在0~5 μmol·L-1范围内线性关系良好, 线性相关系数 r=0.994 3。 由此构建出一种AIE型荧光分子对槲皮素的高选择性、 高灵敏度检测方法, 该方法操作简便、 重复性好, 为具有相似结构药物的检测提供了新的研究思路。

关键词: 荧光探针; 荧光分析; 聚集诱导发光; 电子转移; 配位作用
中图分类号:O657.3 文献标识码:A
Coordination Interaction of DSAZn With Quercetin and High Sensitivity Detection of Quercetin
ZHAI Yan-ke1, PAN Yi-xing1, XIANG Hao1, XU Li1,*, ZHU Ze-ce2, LEI Mi1
1. School of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430072, China
2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Wuhan Textile University, Wuhan 430200, China
*Corresponding author
Abstract

Quercetin is a natural flavonoid compound that is used for the prevention and treatment of hypertension, hyperlipidemia, cardiovascular disease, cancer, etc. Therefore, quantitative detection of quercetin was particularly important in biochemistry and clinical medicine. A highly selective and sensitive detection methodfor quercetin with AIE (aggregation-induced luminescence phenomenon) fluorescent molecules was proposed, which identified the target molecule quercetin through coordination interaction with excited state electron transfer. The fluorescence of DSAZn in PBS buffer at pH 7.0 with adding five drug molecules (quercetin, icaritin, isorhamnetin, rutin and dopamine) was studied.The fluorescence emission spectra of 435~680 nm were scanned by a fluorescence spectrophotometer with an excitation wavelength of 415 nm. The ultraviolet absorption spectrum of 250~750 nm was scanned by ultraviolet spectrophotometer, which showed that the traditional Chinese medicine molecule quercetin could form a complex with the AIE fluorescent probe and thusstaticallyquenchedthe fluorescence of the AIE probe. Fluorescence detection showed that the quenching effect of five drug molecules on the fluorescent probe was significantly different. The binding constant of quercetin and DSAZn was 1.34×107 L·mol-1, which was an order of magnitude higher than that of the other four drug molecules, exhibitinga good selectivity for quercetin. The detection limit of quercetin was 3.07 nmol·L-1, which was lower than the value reported in many kinds of literature, exhibiting a high sensitivity for quercetin. The titrationcurve equation of quercetin to DSAZn based on the fluorescence titration spectrum was: y=0.013 4 x-0.294 82. The linear range of quercetin concentration was 0~5 μmol·L-1 with a linear correlation coefficient of 0.994 3. Thus, a highly selective and sensitivedetection method for quercetin by AIE-type fluorescent molecules was constructed. This method was simply operated and repeatable, which provided a new research idea for detecting drugs with similar structures.

Key words: Fluorescent probe; Fluorescence analysis; Aggregation-induced emission; Electron transfer; Coordination interaction
引言

槲皮素(Quercetin)是最常见的一种生物活性的类黄酮化合物, 难溶于水, 具有抗炎、 降血压、 免疫抑制、 抗肿瘤、 抗血小板聚集和心血管保护等多种药理作用[1]。 目前, 槲皮素的检测方法包括高效液相色谱法[2]、 毛细管电泳-电化学[3]和荧光法[4]等, 其中荧光法具有快速响应和操作简单等优势。 胡玉斐等采用印迹技术制备了一种槲皮素-AI(Ⅲ )聚合物修饰膜(CIP膜), 槲皮素可粘附在CIP膜上, 通过记录CIP膜固体表面的荧光光谱对槲皮素进行检测, 当存在芦丁等结构相似的药物分子时, CIP膜对槲皮素有选择性, 检测限为5 μ g· L-1 [5]。 Wang等合成了具有稳定双发射荧光的硫氮共掺碳纳米带(SNCNRs), 向SNCNRs的PBS缓冲溶液中加入不同浓度的槲皮素, 槲皮素和SNCNRs之间的电子相互作用使它们形成非荧光类配合物, 基于光诱导电子/能量转移或内滤效应荧光猝灭机制, 实现对槲皮素的检测, 在金属离子存在时, SNCNRs对槲皮素具有选择性, 检测限为21.13 nmol· L-1 [6]。 Sachin Kadian等合成硫掺杂石墨烯量子点(SGQDs), 槲皮素和SGQDs形成非荧光基态络合物, 通过内滤效应猝灭SGQDs的荧光, 实现对红酒样品中槲皮素的检测, 该荧光探针在芹菜素等化学结构类似的黄酮类化合物存在时也显示出对槲皮素的选择性, 检测限为0.006 μ g· mL-1 [7]

槲皮素分子结构具有较高的超离域度、 完整的大π 键共轭体系、 强配位氧原子与合适的空间构型, 可与金属离子螯合成稳定的环状配合物[8, 9]。 如图1所示, 槲皮素分子结构中的1个羰基和5个羟基都能提供孤电子对, 具有很强的配位能力。 在中性介质中, Zn(Ⅱ ), Al(Ⅲ )配合物和槲皮素有两个结合位点, 且3-羟基-4酮强于3', 4'-二羟基[10, 11]。 配位作用具有比氢键和静电作用更高的键能, 可以在水等质子化溶剂中稳定存在[12]。 很多基于配位作用的阴离子受体与靶标的结合常数可以达到106 L· mol-1以上[13], 因而以配位作用结合的荧光探针可以有效地在水溶液中发挥检测作用。 此外, 二价锌离子具有全满的3d轨道, 与氮氧原子有较强的配位作用, 廉价且毒性小, 其配合物应用最为广泛。 有研究设计了聚集诱导发光(AIE)[14, 15]分子TPEZn, 以四苯乙烯为荧光发色团, 侧链修饰二联吡啶锌配合物, 通过配位结合实现了在溶液中对焦磷酸及单链核酸的荧光信号增强响应。

图1 中性介质中槲皮素与Zn(Ⅱ )的配位方式Fig.1 Coordination mode of Quercetin with Zn(Ⅱ ) in neutral medium

参考上述研究(见图2), 本工作合成了AIE型荧光探针DSAZn[16], 研究了DSAZn对槲皮素等五种药物分子的荧光响应, 五种药物分子结构如图3所示。 该检测方法灵敏度高、 选择性好、 重现性好, 是一种有效测定槲皮素的分析手段。

图2 AIE荧光分子DSAZn的结构式Fig.2 Structural formula of AIE fluorescence molecule DSAZn

图3 槲皮素(Qc) (a)、 淫羊藿素(AI) (b)、 异鼠李素(Ia) (c)、 芦丁(Ru) (d)、 多巴胺(DA) (e)的分子结构式Fig.3 Molecular structural formulas of quercetin (Qc) (a), icariin (AI) (b), isorhamnetin (Ia) (c), rutin (Ru) (d) and dopamine (DA) (e) were obtained

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

F-4600荧光分光光度计(日本岛津公司); UV-2600紫外-可见分光光度计(日本岛津公司); pHS-3C酸度计(上海雷磁仪器厂); 涡旋震荡仪; 电子天平。

槲皮素(Qc)、 淫羊藿素(AI)、 异鼠李素(Ia)(均购自上海源叶生物有限公司); 芦丁(Ru)(上海毕得医药科技股份有限公司); 盐酸多巴胺(DA)(上海泰坦科技股份有限公司)各分子结构式见图3(a— e); pH 7.4磷酸缓冲盐溶液(PBS)、 二甲亚砜(DMSO), 试剂均为分析纯。 分别配成2.5 mmol· L-1 Qc, AI, Ia, Ru和DA的DMSO溶液, 按需求稀释取用。 AIE型荧光分子DSAZn根据文献[16]合成, 配制浓度为1 mmol· L-1的DMSO溶液。 用pH酸度计调节PBS缓冲液的pH至7.0, 低温保存在4 ℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 检测

准确移取1 mL磷酸缓冲液(PBS, pH 7.0)于荧光比色皿中, 加入10 μ L DSAZn储备液, 再分别加入Qc, AI, Ia, Ru和DA药物溶液, 每次加入后涡旋振荡。 采用F-4600荧光光度计, 激发波长为415 nm, 在435~680 nm范围内记录室温下的荧光光谱。

准确移取2 mL pH 7.0磷酸缓冲液(PBS, pH 7.0)于石英比色皿中, 检测顺序同荧光检测。 采用UV-2600紫外-可见分光光度计, 检测250~750 nm范围内室温下的紫外光谱。

1.2.2 数据分析

使用Origin 2018软件绘图, Chemdraw绘制化合物的结构式, 使用Microsoft Excel对数据进行统计分析。

2 结果与讨论
2.1 药物分子荧光光谱分析

荧光滴定的结果如图4(a— e)所示, 固定DSAZn的浓度, 随着药物分子浓度的增加, DSAZn在550 nm处的发射强度下降, 发射峰位置和峰形基本保持不变, 表明五种药物均能够猝灭DSAZn的荧光。 由图4(f)可以看出, Qc对DSAZn的荧光猝灭幅度最大, 实现了槲皮素的选择性检测。 初始荧光强度(I0)与待测物存在下的荧光强度(It)的比值I0/It-1与槲皮素浓度的线性呈现先快速增长, 再缓慢增长最后达到饱和的趋势。 当槲皮素浓度达5 μ mol· L-1时, DSAZn的荧光几乎被完全猝灭, 此时Qc与DSAZn的摩尔比约为1:2, 说明两分子DSAZn配合物结合一分子Qc。 此外, 荧光检测发现五种药物对DSAZn猝灭效果强弱为Qc> Ia> Ru> AI> DA。 推测由于Qc有两个结合位点可形成化合物配位键, 且具有很强的给电子能力[6], 与DSAZn发生了电子转移, 导致DSAZn发生非辐射能量转移, 因此荧光猝灭较为完全。 而Ru的一个结合位点被糖苷基取代, 尺寸排阻作用较大。 经自由基清除法(DPPH)测定, Qc与Zn(Ⅱ )形成的配合物抗氧化效率(AE)是Ru与Zn(Ⅱ )形成的配合物抗氧化效率的20倍左右[17]。 因此Ru对DSAZn的猝灭效果不如Qc。 AI和Ia缺失邻位酚羟基这一结构, 只有一个结合位点, 据此推测它们与DSAZn的结合能力弱于Qc, 猝灭效果也相应减弱。 如图4(f)所示, 当浓度为5 μ mol· L-1时, Qc的荧光变化幅度是其他药物的6.5倍以上, 此结果表明DSAZn探针对Qc具有选择性。

图4 DSAZn在缓冲溶液中的荧光光谱随药物Qc(a), AI(b), Ia(c), Ru(d), DA(e)加入的变化
F为在pH 7.0 PBS缓冲液中, 10 μ mol· L-1 DSAZn溶液中分别加入5 μ mol· L-1的五种药物后的相对荧光强度变化; 插图为相应溶液在365 nm紫外灯下的照片
Fig.4 Fluorescence spectra of DSAZn in buffer solution with the addition of Qc (a), AI (b), Ia (c), Ru (d), DA (e)
F is the change of relative fluorescence intensity after adding 5 μ mol· L-1 five different drug molecules to 10 μ mol· L-1 DSAZn in PBS buffer solution with pH 7.0. The inset is a photograph of the corresponding solution under a 365 nm UV lamp

如图5所示(左上插图为局部放大图), 在Qc浓度逐渐增加过程中, 550 nm处相对荧光强度(I0/It-1)与Qc浓度在0~5 μ mol· L-1范围内呈良好的线性关系, 重复性好。 其线性拟合方程为y=0.013 4x-0.294 82, 其相关系数r=0.994 3, 表明本方法可用于Qc的定量检测。 采用检测限的计算公式: MDL=3S0/S(S0为标准溶液平行多次检测偏差, S为拟合标准曲线的斜率)。 如表1所示, 计算得Qc的检测限(LOD)为3.07 nmol· L-1, 低于表中文献的参考值, 说明本方法有较高的灵敏度。

图5 在pH 7.0 PBS缓冲液中, 10 μ mol· L-1 DSAZn溶液中分别加入5 μ mol· L-1五种药物后的相对荧光强度变化(I0/It-1)与药物浓度的关系图Fig.5 The relative fluorescence intensity (I0/It-1) and drug concentration after adding 5 μ mol· L-1 five different drug molecules to 10 μ mol· L-1 DSAZn in buffer solution with pH 7.0 PBS

表1 不同检测方法检测槲皮素的性能比较 Table 1 Comparison of different detection methods for quercetin
2.2 槲皮素对DSAZn荧光猝灭机理及结合常数

槲皮素在255和375 nm有两个吸收峰, 415 nm处的吸收峰是DSAZn的特征峰。 四种药物与DSAZn相互作用的紫外吸收光谱图见图6。 由图6(a)可见, 固定DSAZn的浓度, 加入槲皮素后的复合物体系紫外图谱与DSAZn的紫外图谱不重合, 随槲皮素浓度逐渐增加, 415 nm吸收峰强度降低, 说明槲皮素与DSAZn分子发生相互作用, 从而引起DSAZn吸收光谱的改变, 证明槲皮素对DSAZn的荧光猝灭为静态猝灭如图6(b, c, d)所示, 同理可得到AI, Ia, Ru对DSA Zn的荧光猝灭为静态猝灭。

图6 DSAZn在缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱随药物Qc (a), AI(b), Ia(c), Ru(d)加入的变化
滴加药物浓度范围均为0~1 μ mol· L-1, DSAZn浓度为10 μ mol· L-1
Fig.6 Ultraviolet absorption spectra of DSAZn in buffer solution with the addition of Qc (a), AI (b), Ia (c), Ru (d)
The concentration range of dropping drugs was 0~1 μ mol· L-1, the concentration of DSAZn was 10 μ mol· L-1

对于静态猝灭, 荧光分子和猝灭剂结合形成不发光的基态配合物, 根据Stern-Volmer方程[18]: F0/F=1+Kd[Q]计算结合常数。 式中[M]0为荧光分子的总浓度, F0F分别是DSAZn在无猝灭剂和有猝灭剂存在时的荧光强度, Kd为配合物的结合常数。 如图7所示, 以F0/F对[Q]作图拟合为一条直线, 斜率为Kd。 计算结果如图7注所示, DSAZn和Qc的结合常数比其他四种和DSAZn的结合常数大一个数量级, 达到1.34× 107 L· mol-1, 进一步证明了DSAZn和Qc能特异性结合。

图7 五种药物荧光猝灭DSAZn的Stern-Volmer图Fig.7 Stern-Volmer diagram of fluorescence quenching of DSAZn by five drugs

如图8所示, 槲皮素的吸收光谱与DSAZn的发射光谱不重叠, 排除了荧光共振能量转移(FRET)导致荧光猝灭的可能性。 由于Qc是一种强富电子的芳香化合物, 通常作为电子给体, 推测荧光猝灭由电子转移所引起, 如图9所示, Qc和AIE荧光分子DSAZn相互作用并结合为复合物时, 发生了电子转移。

图8 槲皮素的吸收光谱与DSAZn的发射光谱Fig.8 Absorption spectra of quercetin and emission spectra of DSAZn

图9 DSAZn对Qc的荧光响应示意图Fig.9 Fluorescent response of DSAZn to Qc

3 结论

以水溶性有机分子DSAZn为荧光探针, 通过配位作用识别靶标分子槲皮素, 并基于激发态电子转移原理猝灭DSAZn的荧光, 由此构建了一种AIE型荧光分子对槲皮素的高灵敏度检测方法。 此检测法对比了五种药物分子: 槲皮素(Qc)、 淫羊藿素(AI)、 异鼠李素(Ia)、 芦丁(Ru)、 多巴胺(DA)对DSAZn的荧光响应。 采用紫外-可见吸收光谱法分析槲皮素和DSAZn的猝灭类型以及结合机理。 本方法具有灵敏度高、 选择性好、 重现性好等特点, 是一种有效测定槲皮素的分析手段。

参考文献
[1] ZHANG Zhi-qin, ZHU Shuang-xue(张志琴, 朱双雪). Pharmaceutical Research(药学研究), 2013, 32(7): 400. [本文引用:1]
[2] WU Yu-xiang, WANG Xiao-ping, WANG Hong, et al(武玉祥, 王小平, 王虹, 等). Journal of Anhui Agricultural Sciences(安徽农业科学), 2016, 44(13): 164. [本文引用:1]
[3] ZHANG Lan, LIU Yuan-huan, HE Yu, et al (张兰, 刘远环, 何聿, 等). Analysis and Measurement Technology & Instrument(分析测试技术与仪器), 2005, 11(1): 22. [本文引用:1]
[4] WU Shui-hua(吴水华). China Modern Chinese Medicine(中国现代中药), 2012, 14(8): 10. [本文引用:1]
[5] HU Yu-fei, FENG Ting, LI Gong-ke(胡玉斐, 冯婷, 李攻科). Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy(光谱化学学报A辑: 分子与生物分子光谱), 2014, 118: 921. [本文引用:1]
[6] Wang Zhongxia, Gao Yuanfei, Jin Xing, et al. The Analyst, 2019, 144(7): 2256. [本文引用:2]
[7] Sachin Kadian, Gaurav Manik. Food Chemistry, 2020, 317: 126457. [本文引用:1]
[8] QIU Li-juan, MENG Xin, HOU Sheng-shu, et al(邱丽娟, 孟欣, 候升书, 等). Journal of Pharmaceutical Practice(药学实践杂志), 2018, 36(1): 50. [本文引用:1]
[9] JIA Bao-xiu, GU Zhi-liang, LI Yu-qin, et al(贾宝秀, 谷志亮, 李玉琴, 等). Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy(中国现代应用药学), 2014, 31(1): 17. [本文引用:1]
[10] LIN Tian-le, YAN Bao-zhen, HU Gao-fei(林天乐, 严宝珍, 胡高飞). Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化学), 2006, 34(8): 1125. [本文引用:1]
[11] Rubens F V de Souza, Wagner F De Giovani. Redox Report, 2004, 9(2): 97. [本文引用:1]
[12] Kruppa M, König B. Chemical Reviews, 2006, 106: 3520. [本文引用:1]
[13] WU Ya-jun, CHEN Hong-ling(吴亚军, 陈洪龄). Journal of Nanjing University of Technology·Natural Science(南京工业大学学报·自然科学版), 2021, 43(1): 47. [本文引用:1]
[14] Chris Wai Tung Leung, Hong Yuning, Chen Sijie, et al. Journal of the American Chemical Society, 2013, 135: 62. [本文引用:1]
[15] Dan Ding, Li Kai, Liu Bintan, et al. Accounts of Chemical Research, 2013, 46: 2441. [本文引用:1]
[16] Zhu Zece, Zhou Jie, Li Zheng, et al. Sensors and Actuators B: Chemical, 2015, 208: 151. [本文引用:2]
[17] Mora A, Payá M, Ríos J L, et al. Biochem. Pharmacol. , 1990, 40(4): 793. [本文引用:1]
[18] XU Qian-ying, LIU Zhong-fang, HU Xiao-li, et al(许倩影, 刘忠芳, 胡小莉, 等). Chemical Journal of Chinese Universities(高等学校化学学报), 2011, 32(7): 1492. [本文引用:1]