使用的白术样品均为2020年11月实地采集, 前后时间不超过5 d, 以严格控制采摘时间的一致性, 消除白术样品因采摘季节年份不同而引起的差异。 实地采集样品共125份,

其中产自安徽省45份、 湖南省45份, 浙江省35份, 采样地点和采样条件见图1和表1。 使用随机采样算法, 将不同产地白术样本分成训练集(总样本的四分之三, 95个)和测试集(剩余的四分之一样本, 30个)。 另采集10个浙江白术样本作为预测集。

图1

Fig.1

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	图1 本工作中的白术采样点Fig.1 Sampling points of AM in this work

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 白术采样时的地理和天气条件以及样本数(不包括预测集样本) Table 1 Geographical and weather conditions and the number of samples when picking AM (The prediction set samplesare not included) 样本数 东经 北纬 海拔/m 温度/℃ 湿度/% 天气 亳州1 15 115° 37'39″— 115° 37'41″ 33° 44'7″— 33° 44'10″ 15.59~26.61 11.5~16.4 37~43 阴 安徽省 亳州2 15 115° 40'54″ 33° 45'41″— 33° 44'43″ 16.09~24.29 13.1~16.3 30~47 阴 亳州3 15 115° 41'0″— 115° 41'3″ 33° 45'34″— 33° 44'35″ 7.84~36.02 13.1~16.5 38~46 阴 平江1 15 113° 35'38″— 113° 48'4″ 28° 39'13″— 28° 59'28″ 75.5~463.3 10.2~11.2 68~76 阴 湖南省 平江2 15 114° 2'17″— 114° 2'21″ 28° 47'26″— 28° 47'32″ 149.32~158.59 13.2~15.3 56~59 阴 平江3 15 114° 2'16″— 114° 2'18″ 28° 47'25″— 28° 47'28″ 150.00~168.32 11.6~12.7 65~72 阴 磐安 10 120° 23'26″— 120° 23'28″ 28° 56'46″— 28° 56'47″ 60.08~411.71 8.3~10.2 70~91 阴 浙江省 天台 10 120° 49'2″ 29° 12'5″ 512.7 9.8~13.5 56~69 阴 新昌 15 120° 49'11″— 120° 49'13″ 29° 15'8″— 29° 15'26″ 433.3~446.92 12.5~19 49~78 阴 注: 1, 2, 3代表同一地区的不同采样点 Note: 1, 2 and 3 represent different sampling points in the same area

表1 白术采样时的地理和天气条件以及样本数(不包括预测集样本) Table 1 Geographical and weather conditions and the number of samples when picking AM (The prediction set samplesare not included)

鲜白术的处理步骤: 将白术从土壤挖出后, 除去地上茎叶, 保留地下根茎并去除表面的泥土, 放入烘箱内, 每次放同一产地的白术。 第一次烘炕时, 温度为60~70 ℃, 烘炕2~3 h后上下翻动一遍, 使须根干透脱落。 将除去须根的白术取出放到晾晒架上, 使其内部水分外溢, 外皮软化。 24 h后, 进行复炕, 在60 ℃下烘炕24 h, 然后再次放到晾晒架上晾1 d, 使其内部水分充分向外渗出, 再将返润的白术烘烤24 h。 重复烘烤晾晒, 直到白术表面不再有水分渗出, 通常一般需要反复烘炕三次。 将烘干后的白术样品放入中药超细研磨机研成粉末, 再用80目的分样筛进行筛分, 将筛分后的粉末和残渣分别用塑封袋装好并标记相应名称备用。

选用有机试剂作为萃取剂萃取白术所含的有效成分。 以《中国药典》中白术样品提取液的制备方法为基础, 对萃取溶剂、 溶剂的配比和超声时间三个萃取条件进行了优化。

优化步骤: 首先, 选用甲醇和乙醇两种试剂作为萃取剂, 并用超纯水稀释, 分别配制体积分数为100%, 80%, 60%, 40%, 20%和0%的甲醇/乙醇水溶液进行萃取, 离心、 过滤后取上清液进行荧光扫描得到EEM谱图。 为了直观地比较萃取条件的优劣, 从白术的荧光谱图中选取了两个荧光信号峰(激发/发射波长为280/355 nm和激发/发射波长为355/430 nm)进行跟踪分析。 结果如图2所示, 由图2(a)和(b)可以看出, 甲醇和乙醇萃取白术样品的荧光强度非常接近, 无明显差异。 由于甲醇对人体的神经系统和血液系统有一定的毒害作用且甲醇价格比乙醇贵。 综合考虑, 选择乙醇(绿色溶剂)作为萃取剂。 然后对不同体积比的萃取剂进行分析, 其中280/355 nm荧光峰在20%的乙醇水溶液中荧光最强, 355/430 nm荧光峰在40%乙醇水溶液中荧光最强, 考虑到不同产地白术的280/355 nm荧光峰信号值可能存在的差异, 若信号值高于10000仪器将无法检测, 选择体积分数为40%的乙醇水溶液作为萃取剂。 最后, 对超声萃取时间进行优化。 从图2(c)可以看出, 两个荧光峰的强度均不随萃取时间的延长而发生明显变化。 在不影响萃取结果的情况下, 为了缩短实验时间, 最终选择萃取时间为5 min。

图2

Fig.2

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图2 (a)激发/发射波长为280/355 nm的荧光强度与萃取剂种类和萃取剂比例的关系; (b)激发/发射波长为355/430 nm的荧光强度与萃取剂种类和萃取剂比例的关系; (c)荧光强度随超声时间的变化 白术最终的萃取步骤如下: 准确称取400 mg的白术粉末样品于10 mL离心管中, 加入8 mL体积分数为40%的乙醇水溶液, 放入超声机中超声5 min后, 在4 000 r· min-1、 4 ℃的条件下离心10 min, 将上层清液用0.45 μ m微孔滤膜过滤待用。 在EEM测量前, 将已过滤好的上清液用40%的乙醇水溶液稀释10倍再进行荧光扫描。Fig.2 (a) The relationship between fluorescence intensity of excitation/emission wavelength of 280/355 nm and extractant type and extractant ratio; (b) The relationship between fluorescence intensity of excitation/emission wavelength of 355/430 nm and extractant type and extractant ratio; (c) Variation of fluorescence intensity with ultrasonic time

本工作所使用的药品与试剂如下。 药品列表及详细信息见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 白术中可能存在的17种标准物质的中英文名称、 分子量、 浓度、 结构式、 纯度和生产公司 Table 2 Chinese and English names, molecular weights, concentrations, structural formulas, purity and production companies of 17 standard substances that may exist in AM 序号 名称 分子量 浓度/ (μ g· mL-1) 结构式 纯度 公司 1 紫丁香苷 (Syringin) 372.4 0.17 ≥ 98% 博美生物科技有限公司 2 β -谷甾醇 (β -sitosterol) 414.7 9.7 ≥ 98% 博美生物科技有限公司 3 东莨菪内酯 (Scopoletin) 192.2 9.68 ≥ 98% 博美生物科技有限公司 4 羽扇豆醇 (Lupeol) 426.7 8.7 ≥ 98% 博美生物科技有限公司 5 芹菜素 (Apigenin) 270.2 12.52 ≥ 98% 博美生物科技有限公司 6 木香烃内酯 (Costunlide) 232.3 12.34 98% 博美生物科技有限公司 7 7-羟基香豆素 (7-Hydroxycoumarin) 162.1 0.176 ≥ 98% 博美生物科技有限公司 8 咖啡酸 (Caffeic acid) 180.2 8.68 ≥ 98% 博美生物科技有线公司 9 阿魏酸 (Ferulic acid) 194.2 9.82 ≥ 98% 博美生物科技有限公司 10 原儿茶酸 (Protocatechuic acid) 154.1 9.04 ≥ 98% 博美生物科技有限公司 11 白术内酯Ⅰ (Atractylenolide Ⅰ ) 230.3 9.5 ≥ 98% 上海源叶生物科技有限公司 12 白术内酯Ⅱ (Atractylenolide Ⅱ ) 232.3 10.08 ≥ 98% 上海源叶生物科技有限公司 13 白术内酯Ⅲ (Atractylenolide Ⅲ ) 248.3 8.46 ≥ 98% 上海源叶生物科技有限公司 14 木犀草素 (Luteolin) 286.2 8.4 ≥ 98% 上海源叶生物科技有限公司 15 苍术酮 (Atractylon) 216.3 8.42 ≥ 98% 上海源叶生物科技有限公司 16 苍术素 (Atractylodin) 182.2 7.6 99.5% 成都普思生物科技股份 有限公司 17 苍术苷A (Atractyloside A) 448.5 4.68 ≥ 98% 甄准生物科技公司

表2 白术中可能存在的17种标准物质的中英文名称、 分子量、 浓度、 结构式、 纯度和生产公司 Table 2 Chinese and English names, molecular weights, concentrations, structural formulas, purity and production companies of 17 standard substances that may exist in AM

试剂: 甲醇和乙醇(均为色谱纯)购买自Sigma-Aldrich(圣路易斯, 美国); 超纯水(18.20 MΩ · cm)由Milli-Q超纯水系统(Millipore, 美国)生产。

偏最小二乘判别分析(PLS-DA)是一种线性分类方法, 将偏最小二乘回归算法用于分类判别, 详见文献[12]。

k最邻近法(kNN)是一种经典的有监督非线性分类算法, 根据样本周围最近k个样本的最大类别概率来判断样本的归属类型, 具体实现步骤如下: (1)计算测试样本数据与各训练样本数据之间的欧氏距离; (2)将获得的距离值从大到小进行排序; (3)选择距离值最接近的k个训练样本并记录其分类, 通过留一交叉验证法选择最优的k值; (4)统计前k个点所在类别出现的频率; (5)返回前k个点出现频率最高的类别作为当前点的预测分类。

交替三线性算法(ATLD)于1996年由吴海龙等提出, 是一种高效的“ 数学分离” 算法, 可对三线性数阵进行解析, 并提供有明确物理化学意义的解析结果, 基于所获得的各组分轮廓矩阵可进行更深入的定性和定量分析^[13]。 ATLD与传统平行因子分析(PARAFAC)相比, 所需内存大大减少, 运算的效率极大提高, 是现存迭代三维校正算法中收敛速度最快的一种算法。 详情见文献[14]。

实验所有白术样品的EEM测量均在一台装配了150 W氙灯的F-7000荧光光谱仪(日立, 日本)上进行, 并连接一台电脑用于读取数据, 测量时配合使用10 mm的石英比色皿。 仪器相关参数: 激发波长范围为200~600 nm(步长5 nm); 发射波长范围为200~650 nm(步长5nm); 扫描速度为30 000 nm· min^-1; 检测电压为650 V; 狭缝宽度为5.0 nm。 数据均保存为.txt格式。 本工作所有的数据处理均在MATLAB环境下进行, 使用classification-toolbox 5.1中的PLS-DA和kNN对样本进行数据分析, 可从网址http://www.michem.unimib.it/download/matlab-toolboxes免费获取^[12]。 PLS-DA方法的LVs(最佳潜变量数)和kNN方法的k(邻近样本数)均通过留一交叉验证所获得的最佳分类准确率(CCR)来确定。 在CCR相同的情况下, 优先选择最小的LVs和k值。 CCR可被视为总体精准度, 通过式(1)计算

CCR=∑g=1GnggN(1)

式(1)中, n_gg为原本属于第g类的样本被正确分到第g类的样本数量; N为总样本数; G为总类别数。

各样本原始的EEM数据是在激发波长范围为200~600 nm, 发射波长范围为200~650 nm下采集的。 为了简化运算并消除无用信息, 选择一个包含白术样本主要荧光特征的较小荧光区域用于后续分析。 该区域的激发波长范围为200~560 nm, 发射波长范围为200~620 nm, 每一个矩阵数据的大小为73× 85(激发波长数× 发射波长数)。 由于EEM光谱中存在严重影响数据三线性结构的瑞利散射和拉曼散射, 因此必须对其进行预处理。 每个样本矩阵都减去三个空白样本(体积分数为40%的乙醇水溶液)矩阵数据的平均值, 以此来消除轻微的拉曼散射, 瑞利散射通过Bro等提出的插值法^[15]来消除。 该算法首先直接把散射区域扣除, 然后再通过插值法拟合缺失数据, 如图3(a, b, c)所示。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 插值法消除EEM数据中瑞利散射 (a): 具有可见瑞利散射的原始数据; (b): 扣除瑞利散射后的缺陷数据; (c)使用插值法修复后的数据Fig.3 Rayleigh scattering eliminated from EEM data by interpolation (a): Raw data with visible Rayleigh scattering; (b): Defect data after deducting Rayleigh scattering; (c): Data repaired by interpolation

图4(a, b, c)分别为预处理过后不同地区白术的典型EEM谱图, 从图4中可以看出不同地区的白术EEM谱图存在一定的相似性和差异性。 例如在激发/发射波长355/450 nm处都存在一个强荧光峰。 安徽白术样本在激发/发射波长275/370 nm附近有一个信号比较强的荧光峰, 而浙江白术样本该处信号较弱, 湖南白术样本在该处几乎没产生荧光信号, 实验结果反映出不同地区白术的内源荧光成分和微环境有所差异。 不同产地白术EEM谱图的强度、 形状和位置的差异性和相似性为随后采用化学计量学方法分类提供一定的可能和挑战。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 扣除散射后不同地区白术样品典型EEM等高线图 (a): 安徽白术样本; (b): 湖南白术样本; (c):浙江白术样本Fig.4 Typical EEM contour map of AM samples in different provinces after deducting scattering (a): Anhui AM; (b): Hunan AM; (c): Zhejiang AM

首先, 将135个白术样本荧光数阵沿着样本维方向进行堆叠, 得到一个大小为73× 85× 135(激发波长数× 发射波长数× 样本数)的三维数阵, 再采用ATLD算法对三维数阵进行分解。 在ATLD分解之前, 通过核一致性诊断算法(CORCONDIA)^[16]对其组分数(N)进行估计, 当CORCONDIA结果大于60%时, 可认为模型符合三线性。 最终确定组分数N=3, 此时ATLD解析三维数阵得到的结果如图5所示。 图5(a, b, c)分别为归一化激发光谱图, 归一化发射光谱图和相对浓度图。 从图5(a, b)分别可以看出: 组分1(蓝色)的激发/发射波长为365/440 nm; 组分2(绿色)的激发/发射波长为405/470 nm; 组分3(红色)的激发/发射波长为280/360 nm, 其在激发波长225 nm和发射波长450 nm处各存在一个明显的肩峰。 值得注意的是, 这里所指的“ 组分” 可能并不代表具体某一种物质, 而通常是某一类荧光信号接近的物质(共因子)。 为了更加准确直观地分析三组分各代表的物质, 对白术中可能含有的17种物质进行了三维荧光扫描, 随后对有明显荧光信号的七种内源荧光物质进行分析, 得到的归一化激发光谱图6(a)和归一化发射光谱图6(b), 如图6所示。 通过比较分析图5和图6各组分的激发/发射波长, 考虑白术复杂的内源环境, 做出以下推测: 组分1所代表的物质可能为7-羟基香豆素和东莨菪内酯; 组分3所代表的物质可能为紫丁香苷、 原儿茶酸和苍术酮; 组分2无对应物质, 暂定为未知物质。 由图5(c)可看出不同产地白术所含三组分浓度的差异, 其中组分1在安徽、 湖南和浙江白术中含量无明显差异, 组分2含量在安徽、 湖南和浙江白术中呈上升趋势, 组分3在安徽白术中含量最高, 在湖南和浙江白术中含量较低。 通过分析各组分所可能代表的物质以及各组分在不同产地白术的含量差异, 可以看出不同产地白术的荧光数据存在一定的差异, 为其产地溯源提供了依据。

图5

Fig.5

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	图5 N=3时ATLD解析三维矩阵获得的归一化激发光谱图(a)、 归一化发射光谱图(b)和相对浓度图(c)Fig.5 The normalized excitation spectra profiles (a), the normalized emission spectra profiles (b) and the relative concentration spectra profiles (c) obtained by ATLD analysis of three-way matrix with N=3

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 白术中可能含有的7种具有荧光信号的标准物质的归一化激发光谱图(a)和归一化发射光谱图(b) 2.3 白术产地分类Fig.6 The normalized excitation spectra profiles (a) and normalized emission spectra profiles (b) of 7 standard substances with fluorescence signals that may be contained in AM

使用PLS-DA和kNN两种模式识别方法对不同产地的白术进行分类。 首先通过交叉验证来优化PLS-DA的LVs以及kNN的k值。 根据交叉验证的结果, 最终确定PLS-DA的LVs为10, kNN的k值为2(见表3)。 表3列出交叉验证模型中两种方法获得的分类准确率(CCR%), 其中PLS-DA的CCR为91%, kNN的CCR为88%。 为了更好地评估分类性能, 表3给出了特异性和灵敏度两种品质因子参数, 特异性表示模型拒绝所有其他类别样本的能力, 灵敏度表示模型正确识别该类样本的能力。 PLS-DA在交叉验证中对于各类别获得的特异性、 灵敏度分别在92%~98%和81%~97%范围内, 而kNN分别为93%~95%和85%~91%, 这意味着两个分类模型均能比较有效地识别该类样本并拒绝他类样本。 同时, 使用以上两种方法验证了训练集样本的类别, 所得分类结果如表3所示。 其中PLS-DA方法的CCR为100%, 且其特异性、 灵敏度都为100%, 能完全准确地对训练集的样本归类。 而kNN方法的CCR为88%, 稍逊于PLS-DA的结果。 可以明显看出, 无论是特异性还是灵敏度, 安徽白术的检测结果都略大于湖南白术和浙江白术。 另外, 可以通过PLS-DA解析训练集时前3个潜变量的得分值所作出的三维散点图可更直观地比较分类结果, 如图7所示。 从图7可以看出, 安徽、 湖南和浙江白术在三维空间中被大致的区分开来, 其中安徽白术明显与湖南和浙江白术区分开, 而湖南白术和浙江白术有少量重叠, 很好地解释了安徽白术的分类结果略大于湖南和浙江白术的原因, 也说明了为什么在表4(支持信息)混淆矩阵中, 湖南白术和浙江白术都有少量被相互误分。 用上述已验证的白术分类模型来对测试集样本进行预测, 结果如表3所示。 其中对于测试集, PLS-DA的CCR为87%, 而kNN的CCR仅为73%。 从整体来看, 两种分类方法均获得较高的分类准确率, 其中PLS-DA最令人满意, 交叉验证、 训练集和测试集获得CCR都比kNN高, 且结果比较稳定。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 PLS-DA和kNN两种分类模型的复杂度参数(LVs/k), 交叉验证、 训练集、 测试集和预测集获得的分类准确率、 特异性和灵敏度 Table 3 The complexity parameters (LVs/k) of the PLS-DA and kNN classification models, the classificationaccurate rate, specificity and sensitivity obtained by cross-validation, training set, test set and prediction set 模型 LVs/k CCR/% 特异性a/% 灵敏度b/% 安徽 湖南 浙江 安徽 湖南 浙江 交叉验证 91 98 92 96 97 91 81 PLS-DA 10 训练集 100 100 100 100 100 100 100 测试集 87 95 89 95 100 91 63 交叉验证 88 95 93 94 91 88 85 kNN 2 训练集 88 95 93 94 91 88 85 测试集 73 89 89 82 100 55 63 Note: a The specificity is defined by TN/(TN+FP), TN: True Negatives, FP: False Positives; b The sensitivity is defined by TP/(TP+FN), TP: True Positives, FN: False Negatives 注: a特异性定义为TN/(TN+FP), TN: 真阴性, FP: 假阳性; b灵敏度定义为TP/(TP+FN), TP: 真阳性, FN: 假阴性

表3 PLS-DA和kNN两种分类模型的复杂度参数(LVs/k), 交叉验证、 训练集、 测试集和预测集获得的分类准确率、 特异性和灵敏度 Table 3 The complexity parameters (LVs/k) of the PLS-DA and kNN classification models, the classificationaccurate rate, specificity and sensitivity obtained by cross-validation, training set, test set and prediction set

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 根据PLS-DA前3个潜变量的得分值所作的训练样本三维散点图Fig.7 Three-way scatter diagram of training samples based on the scores of the first three latent variables of PLS-DA

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 白术分类模型中PLS-DA和kNN分类方法获得的训练集、 测试集和预测集的混淆矩阵 Table 4 Confusion matrix of training set, test set and prediction set obtained by PLS-DA and kNN classification methods in AM classification model 模型 真实 PLS-DA kNN 预测 安徽 湖南 浙江 安徽 湖南 浙江 安徽 34 0 0 31 1 2 训练集 湖南 0 34 0 2 30 2 浙江 0 0 27 1 3 23 安徽 11 0 1 11 1 1 测试集 湖南 0 10 2 0 6 2 浙江 0 1 5 0 4 5 安徽 0 0 1 0 0 0 预测集 湖南 0 0 1 0 0 1 浙江 0 0 8 0 0 9

表4 白术分类模型中PLS-DA和kNN分类方法获得的训练集、 测试集和预测集的混淆矩阵 Table 4 Confusion matrix of training set, test set and prediction set obtained by PLS-DA and kNN classification methods in AM classification model

表4列出了训练集和测试集中两种分类方法所获得的混淆矩阵, 从表4可以非常直观地看出两种模型对样本的分类结果。 其中, PLS-DA分类方法在训练集和测试集都能100%正确地对安徽白术进行分类, 而对湖南和浙江白术, 无论是PLS-DA还是kNN, 都不能对其进行100%正确的归类, 而绝大多数样本都被正确地归类。 总之由于白术内源荧光物质的多样性和体系的复杂性, 再加之荧光光谱有着较大的重叠部分, 因此获得以上分类结果还是非常理想的。

为了更好地检验两种模型对白术样本的正确分类能力, 证明本模型能对白术道地药材进行产地溯源, 从浙江省金华市磐安县和台州市天台县共采集10个新的浙白术药材样本, 并使用所建立的两个模型对其进行预测, 预测结果如表3和表4所示。 其中PLS-DA的CCR为80%, 只有两个样本被错误分类, kNN的CCR为90%, 只有一个样本被错误分类到湖南。 结果表明, 两种模型即使在面对未知的白术样本时, 仍能有效地识别该样本并正确对其产地进行预测。 进一步验证了本工作所提方法的可行性与可靠性, 证明本方法能有效地对白术进行产地溯源。