酚羟基的电导滴定法是将一种已知浓度的试剂滴加到含酚羟基的待测物质的介质中, 根据电导率的改变决定滴定终点, 通过试剂的浓度、 消耗的体积, 计算出酚羟基的浓度。 欧义芳等^[5]提出了在含有少量水的有机溶剂中, 利用电导滴定测定未漂桉木纸浆中的酚羟基方法。 滴定介质可以是丙酮、 吡啶、 乙醇和水, 滴定剂为KOH-异丙醇, 待测样浓度为2.0 g· L^-1。 在同样的滴定条件下, 刘华武等^[15]在样品浓度为2.5 g· L^-1条件下, 可以同时测出木质素中酚羟基和羧基的浓度, 测得的酚羟基量误差小于2.0%。 同样的条件下, 仝丽丽等^[16]以芦苇乙醇木质素为原料, 通过苯酚改性增加木质素上酚羟基的含量, 为快速准确测定其他种类木质素上的羟基、 羧基含量提供了理论依据。

电位滴定测量滴定木质素的酚羟基的方法与电导滴定法相似, 不同点在于它是以测量电位变化来确定滴定终点的方法, 其主要适用于滴定酚羟基浓度较小的待测样品(水或非水溶液), Butler等^[6]使用了非水电位滴定来对木质素的酚羟基和羧基进行定量, 该实验选取了铁杉木质素作为原料, 首先将样品溶于二甲基甲酰胺, 加入偶氮紫指示液, 再用甲醇钾的苯甲醇溶液来滴定, 得到的酚羟基含量范围为2%~8%; 后来Pobiner^[17]改良了电位滴定方法, 选用对羟基苯甲酸作为内标物, 用四丁基氢氧化铵的甲醇溶液来滴定木质素磺酸钠, 得到酚羟基和羧酸基浓度, 并使滴定曲线得以修正, 结果准确度大幅度地提升。 而周明松等^[18]使用水相的电位滴定分析易溶于无机碱性溶液的碱木质素与木质素磺酸钠, 得到的酚羟基含量分别为2.8和1.3 mmol· g^-1, 打破了非均相溶剂体系的禁锢, 让能溶于无机碱性溶液的多种木质素中酚羟基和羧酸基的浓度都能被有效地定量测量, 在一定程度上简化了实验操作并拓展了定量方法。

Serrano等^[19]提出了一种不使用有害溶剂、 快速、 经济、 简便的木质素酚羟基定量新方法, 首先测量水介质中的酸碱度, 再进行电导滴定和酸碱滴定, 并联合紫外可见光度、 ³¹P-核磁共振、 ¹H核磁共振、 ¹³C核磁共振、 Folin-Ciocalteu试剂和氨解-气相色谱进行分析。 结果表明, 该方法与紫外可见光度和³¹P-核磁共振(最精确的方法)有良好的统计相关性, 数据具有较小的变异性(约10%)。

早在1954年, Goldschmid^[20]基于苯酚在碱性溶液中的特征紫外吸收测定了酚羟基含量, 将样品在碱性溶液的吸光度与在中性溶液的吸光度进行比较并制作差异曲线, 酚羟基含量根据曲线中的最大吸收值计算。 原理为: 在碱性条件下, 木质素吸收光谱中羟基电离会产生红移和增色位移^{[21, 22]}。 当吸收最大值转移到更长的波长时, 即发生红移, 而在某一波长下, 增色位移会导致吸收强度的增加^[23]。 通过从碱性光谱中减去中性光谱, 获得电离差光谱(δ 光谱), 酚羟基的类型不同, 特征最大值也不同。 该方法假设木质素在溶剂中完全溶解, 如果不满足这个条件, 酚羟基的实际数量会偏低。 测量时必须使用适当的木质素模型化合物(例如苯酚、 香草醛以及邻甲氧基苯酚等)或已知酚羟基含量的木质素进行校准, 该方法可应用于大多数来源的木质素。 吴保国等^[24]在紫外可见光度法的基础上进一步改进了木质素酚羟基基团的测定方法。 在该方法中, 使用了水而不是二恶烷作为溶剂, 在微分紫外可见光谱中确定模型化合物的最大吸收带为250 nm, 建立了吸收强度与酚羟基含量之间的线性回归方程。 以桦木, 芦苇, 朝鲜松和落叶松的硫酸盐木质素为研究对象, 计算了各自酚羟基含量, 得出改进的紫外可见光度法所测的结果与化学测定相当接近。

紫外可见光度法是一种基于使用特定的已知浓度的标准物进行检测的方法, 在数据处理上有一定的局限性, 由于木质素结构的复杂性, 会造成木质素在紫外可见光谱除250与300 nm之外也有吸光度, 这就导致了测定值的偏小^{[25, 26]}。 对于木质素降解过程中的羟基含量(包括酚羟基和烷基羟基的量), 常使用化学滴定法测量木质素样品的总羟基含量, 再使用氢氧化钠溶液滴定乙酰化木质素样品, 然后计算总羟值。 木质素样品的酚羟基含量则通过紫外可见光度法测定^[27]。 Goldmann等^[21]基于电离差紫外可见光度法(Δ ε -方法), 考虑了斜率因素来对其进行改进, 这样可以消除在计算质量消光系数时的实验变化影响。 以¹³C-核磁共振定量测定结果为对照, 通过测量有机溶剂木质素和硫酸盐木质素的酚羟基含量来评价此方法的可靠性。 结果表明, 这是一种可以快速检测木质素的酚羟基含量方法。

与上述方法相似, 利用酚羟基反应后物质与其自身成比例的原理, 还有一种简单快速测定木质素中酚羟基的方法— — Folin-Ciocalteu试剂法(简称FC法)^[28]。 FC法是得名首次发现这种方法的Folin和Ciocalteu, 该方法的核心就是异磷钨酸盐-钼酸盐与酚羟基产生特定的反应, 生成产物与总酚羟基量具有很好的线性关系, 符合可见分光光度法定量测量原理。 该方法的特点是其不仅可以快速、 便捷地测定木质素中酚羟基的含量, 而且可以直接测定纸浆中酚羟基的含量, 且测定的数据可靠性更好。 赖玉荣等^[7]使用FC法评价了用过氧化氢氧化降解硫酸盐木质素的降解效果, 通过比较降解起始与结束酚羟基浓度的变化来确定降解过程生成的酚羟基, 并且还比较了不同纸浆残余木质素中酚羟基的浓度。 Rover等^[29]将FC法用于定量确定生物油中的总酚, 该方法基于福林酚(FC试剂)对酚类化合物的氧化作用, 通过使用阳性和阴性对照评估了其相对于干扰物的准确性。 并且将此法与液-液萃取测量得到的生物油中的总酚含量相比较, 结果发现总酚含量基本相同。

紫外可见光度法和FC法测定的酚含量值有些许差异, 可能是由于福林酚试剂测定的是还原能力, 它不是测定酚含量的特定方法。 紫外可见光度法根据酚类物质在紫外区有吸收光谱原理, 直接通过光谱扫描测定酚羟基含量, 测定结果不仅是所有酚类物质的含量, 带有酚羟基基团的物质都可以被检测到。 FC法是测定酚含量的常规方法, 但由于操作方便、 精密度高, 紫外可见光度法也是酚含量测定的普遍方法。 两种方法的测定结果经回归计算, 均呈良好的线性关系^[30]。

高效液相色谱法(HPLC法)既可以定性分析也可以定量分析。 其中定性的主要方法是与已知标准物对照, 即使更换色谱柱或洗脱液的组分发生变化时, 只要待测物峰的保留值跟标准物一样时, 也可得出此待测物与标准物可能是相同化合物。 以反相色谱为例, 梯度洗脱时, 待测品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口, 由于起点流动相中强洗脱溶剂含量较低。 一段时间后, 洗脱溶剂增加, 化合物1在柱中的移动速率明显增大, 并且随着洗脱溶剂的增加, 其移动速率愈加快速, 直到流出色谱柱, 被检测器检测。 洗脱溶剂持续增加, 在随后的某个时间点, 化合物2移动速率也开始变快, 并与化合物1类似的方式被洗脱出色谱柱。

定量的最常采用方法是外标法, 先用待测物的标准样品配比不同浓度, 色谱条件和待测组分一样的, 量取相同体积精准进样, 之后测量每个峰的峰高或峰面积, 得到过原点的待测样品浓度标准曲线, 最终可以直接从曲线上读出各种酚类化合物浓度。 通常用于分析木质素衍生酚类化合物的传统色谱方法较为复杂, Yan等^[8]开发了一种新的超高性能液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法来分析木质素中的酚类物质, 该方法基于聚合物吸附剂的固相萃取和反相色谱法进行样品净化, 可分离所有木质素衍生酚, 同时将来自共洗脱基质成分的干扰降至最低。 对于超低木质素酚浓度和高基质干扰, 该方法具有稳健性和适用性, 且简单快速的样品制备与无需衍生的分析相结合, 使其适用于常规和大容量分析。 Sun等^[31]设计了一个超高性能的超临界流体色谱与二极管阵列检测器的方法, 检测由碱性氧化铜氧化木质素衍生产生的酚类化合物。 在对11种代表性单体木质素酚类化合物的分析中, 所有化合物在短时间内清晰分离, 峰形极佳, 表明该方法可以对木质素衍生酚类化合物进行定性和定量分析。

Lobbes等^[32]使用反相高效液相色谱二极管阵列检测器检测了木质素产生的酚类物质, 使用氧化铜氧化而产生的多种主要酚类物质被清晰、 快速地分离出来。 二极管阵列检测也可检测单个高效液相色谱峰内的干扰杂质, 使木质素衍生酚得到了校正和量化。 江智婧等^[33]使用反相高效液相色谱法来定量检测玉米秸秆在蒸汽爆破环境下木质素的降解物, 在经过数据处理后, 得到的木质素降解物的线性回归方程具有良好的线性关系, 加标回收率也都高于96%, 相对标准偏差也很低, 充分符合对于定量检测木质素降解物的要求。

核磁共振谱图法(NMR法)也应用于木质素降解后酚羟基的定量检测, 主要的核磁共振谱图有氢谱, 碳谱与磷谱。 核磁共振技术的发展使木质素定量检测迈上了一个新的台阶。 Tiainen等^[34]提出了一种可靠的分析改性和未改性木质素样品的方法— — ¹H核磁共振方法, 相较于紫外可见光谱法对邻苯二酚单元环中的第二个芳族羟基检测的限制, 核磁共振谱图能很好地反映木质素中酚羟基的存在。 ¹H核磁共振方法是一种通用的方法, 不需要特殊的样品制备, 弱酸性溶液洗涤即可用于检测。

核磁共振谱图的定量原理是基于谱图中信号的峰面积与所检元素(如³¹P)的数目存在正比关系, 所检元素的化学性质对检测无影响, 只需对该化合物中指定基团上质子共振造成的峰面积进行积分, 即可得到绝对含量^[35]。 目前, NMR定量方法分为两类^[36], 其中, 外标法是称取一定已知含量的标准品配成一系列不同浓度的标准溶液, 在同样试验要求下, 标准曲线以浓度与特征峰面积作为横纵坐标制得, 得到待测溶液的NMR谱图, 积分相应的峰面积, 再代入曲线计算可以得到待测样浓度。 而内标法则是用已知纯浓度的标准物当作内标物, 向待测样溶液中添加已知量的内标, 由内标化合物特征峰面积与样品中某一特征峰面积的比值即可计算样品浓度。 内标法的计算公式为^[37]

mx=mstd×Mx×(Ax/nx)Mstd×(Astd/nstd)

式中: m_x为待测物含量, mg· L^-1; m_std为内标含量, mg· L^-1; M_x为待测物分子量; M_std为内标分子量; A_x为待测物定量峰信号面积; A_std为内标物定量峰信号面积; n_x为待测样品定量峰包含的磷原子数; n_std为内标物包含的磷原子数。

³¹P NMR波谱分析技术因其独特的表征能力和广泛的潜在适用性, 使其成为一种颇具前途的羟基分析技术。 与传统的化学分析技术相比, 定量³¹P NMR波谱分析技术在单谱高分辨率测定羟基含量方面具有一定的优势。 ³¹P NMR在较短的时间内以及采用30 mg的样品即可提供完整的定量信息^[38]。 Faleva等^[39]将³¹P NMR光谱法用于检测和定量云杉和桦木韧皮部木质素游离酚羟基, 对于云杉韧皮部-二恶烷木质素, 游离酚羟基的含量很高(占木质素重量的10%), 大部分酚羟基来自于愈创木基和对羟苯基单元, 同时, 儿茶酚型和对羟基苯基型游离酚羟基在云杉韧皮部木质素组成中有着很大的占比。 Argyropoulos等^[9]使用磷化试剂(1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷氯化物)以及弛豫试剂(乙酰丙酮酸铬)处理样品, 采用内标法定量检测木质素的酚羟基含量。 此法可以发现木质素三种前体类型中酚羟基在制浆过程降解的特点且测得其含量。 核磁共振磷谱的定量分析无需待测样的标准物, 而且原理简单, 准确度较高。 但核磁共振磷谱的定量也存在一些不足, 比如灵敏度不高, 对微量成分进行准确定量仍存在难度; 并且核磁共振设备的普及率远不及其他色谱仪器, 导致磷谱的定量技术发展缓慢。

¹³C NMR波谱分析技术在提供木质素详细结构信息方面具有重要的潜力, 特别是二维核磁共振技术的出现, 大大扩展了木质素结构分析的前景。 同时, ¹³C NMR在定量测定木质素不同结构单元含量中是必不可少的方法^[40]。 乙酰化木质素的酚乙酰基可以通过核磁共振波谱技术进行测定, Robert等^[10]用亚硫酸盐蒸煮液在不同条件下对杨木木材样品进行蒸汽爆炸处理, 以氘代二甲基亚砜为溶剂, 将纯化后的木质素磺酸盐通过¹³C-NMR定量。 将分析数据与元素分析和甲氧基分析相结合, 对木质素蒸汽爆炸过程中的酚羟基变化进行了综合描述, 并给出了磺化程度的信息。 Capanema^[41]等结合NMR技术, 提出了一种用于量化磨木木质素(MWL)中不同木质素结构的详细方法。 该方法发现未乙酰化和乙酰化的云杉MWL的¹H-¹³C异核多量子相干性和定量¹³C NMR具有协同作用, 从而在通过NMR表征木质素部分方面取得了重大进展。

¹H NMR波谱分析技术是根据氢谱中不同质子的化学位移、 偶合常数及峰的裂分情况来分析某些官能团的特定质子, 并测出各种官能团中氢质子的数目之比, 这对推断结构式至关重要。 氢谱的优点是谱图中氢的积分峰面积正好跟氢原子数是正比关系, 精准度远高于紫外可见光谱。 Li等^[11]深入研究了采用¹H NMR技术以解析木质素结构并估算云杉磨木木质素中不同结构酚羟基的含量, 如5-5’ 、 β -O-4、 β -5’ 、 醛基、 羧基等。

对于上述三种核磁共振(磷谱、 碳谱和氢谱)定量方法, 杨喻^[42]从测定结果、 测定结构和测定条件等方面总结评价了它们的优缺点。 从测定结果方面看: ¹H NMR法、 ¹³C NMR法与³¹P NMR法测定得到的酚羟基含量均很接近, ¹H NMR法和¹³C NMR法准确性高。 从测定条件方面看: ³¹P NMR法虽然测定时间短(9 min左右), 但在测定时所需磷化试剂TMDP购买周期很长且价格昂贵, 若自制磷化试剂因其毒性大、 操作复杂而难以快速检测; 而且制样样品极不稳定, 需要现配现测。 ¹³C NMR法则需要较长的检测时间(9 h左右)才能够得到质量较好的核磁谱图, 且需要70~100 mg样品。 ¹H NMR法测定木质素样品则需使用少量(2 mg左右)的干燥木质素样品用于检测, 且检测时间仅需30 min左右便可得到谱图。 所以综合来看, ¹H NMR法是一种快速准确、 节约样品、 无毒无害的定量测定木质素酚羟基结构含量的方法。

除了核磁共振磷谱、 碳谱和氢谱定量检测, 近年来氟谱的发展也不容忽视。 Esakkimuthu等^[43]选择含酚和脂族羟基的木质素模型化合物进行氟苄基化反应, 所得反应介质用¹³C和¹⁹F核磁共振谱分析。 模型化合物结果显示酚羟基完全衍生化, 而脂肪族羟基的转化率最低, 并证实¹⁹F核磁共振化学位移从1.15× 10^-4到1.17× 10^-4对应的是酚基。 ¹⁹F核磁共振分析可以成功地应用于氟苄基化后的有机溶剂商业木质素, 以确定其酚基含量。 Esakkimuthu^[44]将5种工业木质素的羟基衍生乙酰化与氟衍生方法(氟苄基化和氟苯甲酰化)进行比较, 通过电导和电位滴定, 氨解-气相色谱, 红外和差示紫外可见光谱以及(¹H, ¹³C, ¹⁹F和³¹P)NMR光谱法对羟基官能团进行定量。 氟衍生化增加了木质素在溶剂中的溶解度并改善了色谱结果, 且可对羟基官能团进行精确定量。

单独使用气相色谱可对酚类化合物进行高效分离与鉴别, 而质谱的加入使其鉴别更加精准, 可以对其中酚类化合物逐个作出定性鉴别与定量分析。 Ma等^[45]使用顶空固相微萃取技术与气相色谱-质谱技术(GC-MS), 将每种挥发物的峰面积与总峰面积进行比较, 对鉴定出的挥发油进行半定量, 按照归一化方法得到挥发性化合物的相对百分比含量, 可以初步鉴定并确定58种挥发性化合物(包括苯酚在内)。 Pierce等^[46]介绍了一种用气相色谱/质谱法分析苯酚等物质的方法。 这种衍生技术是通过提高色谱性能和在分析物中引入可追踪的基团, 进而提高分析的灵敏度。 通过选择性地使用离子监测, 该方法可适用于苯酚的定量分析。 Fang等^[12]以商业木质素磺酸钠在温和条件下的解聚溶液为基础, 使用气相色谱-质谱联用仪很好地建立了一种用于表征实际木质素解聚产物的改进方法, 该方法能够检测主要的37种木质素基芳香族产物, 通过绘制标准曲线, 根据相对峰面积对这些近似产品进行量化评估。

酚类化合物具有高极性、 高沸点以及邻、 对甲酚之间的分离困难等特点, 使得它们的气相色谱分析变得困难。 大多数低分子量的单官能团酚具有足够的挥发性用于气相色谱分析, 但是它们会带来宽尾峰。 这些化合物在微量水平上的分析通常受到它们在柱中的吸附、 “ 重影” 现象以及一些气相色谱检测器的低灵敏度的限制。 另外由于酚羟基的极性, 很难对这些化合物进行分析, 这极易导致样品制备过程中分析物的损失。 为了克服这些缺点, 酚羟基通常选用合适的衍生试剂进行衍生, 衍生后的酚羟基可产生更尖锐的峰, 使样品得到更好的分离和更高的灵敏度。 此外, 合适的样品制备程序也至关重要, 如微萃取技术和衍生反应^[47]。 微萃取方法因其简单、 环保和低成本的特点而作为经典萃取和样品制备方法。 曾家源等^[48]采用固相萃取-气相色谱法一次性检测定量了多种酚类化合物, 整个过程不需要衍生反应, 工艺简易, 准确度也很高。 工程中采用的是固相萃取柱富集, 使用外标法定量分析, 绘制的曲线具有良好的线性关系。

气相色谱法(GC法)用于定量测定酚羟基是基于化学反应的基础上, 对其衍生的气体进行测定的方法, 其主要包括氨解法与高碘酸盐氧化法。 其中, 氨解法需要对样品进行乙酰化, 选用的试剂一般为吡咯烷。 对于木质素降解物的酚羟基定量测量, 首先将木质素降解物进行乙酰化反应, 由于乙酰化后木质素产物在进行氨解反应时会很快断裂酚乙酰基, 而此时脂肪族乙酰基断裂速度过慢可忽略不计, 气相色谱一开始检测到的1-乙酰吡咯烷的量, 对其进行换算即可得到酚羟基的含量。 由于脂肪族乙酰基的氨分解会导致测量结果不是非常精准, 相比于上述的一些方法, 此法也存在不足, 例如测定过程不简便, 检测时间过长等。 木质素中羟基的总量通过乙酰化样品的完全皂化(氢氧化钠), 然后用气相色谱法测定释放的乙酸及其苄酯的量来估算^[13]。 而高碘酸盐氧化法, 主要是采用高碘酸盐作为氧化剂, 对木质素降解物的酚羟基(木质素结构中甲氧基与酚羟基是邻位)进行氧化, 产生甲醇, 然后通过气相色谱法对其进行定量测定, 最后换算成木质素降解物中酚羟基的含量。 由于高碘酸盐的氧化性较强, 对样品的要求降低, 可检测大多数木质纤维原料中的酚羟基含量^[49]。 正如上述所言, 酚羟基与甲氧基相邻才能被检测到, 若某些邻位缺少甲氧基(例如对羟苯基与儿茶酚型酚羟基等), 则其无法被检测到, 导致该方法存在一定的局限性。 Lai等^[14]使用高碘酸钠溶液对云杉和白杨木进行氧化, 通过定量检测甲醇挥发量来换算木质纤维原料中酚羟基的具体含量, 经过对比, 使用高碘酸盐氧化定量检测的两种木质原料的酚羟基量与氨解法测量得到的基本一致。