适体是一组单链DNA或RNA分子, 可以通过范德华力、 氢键、 疏水和静电相互作用结合到靶向细菌的表面。 适体的体积小, 易于合成和标记, 缺乏免疫原性, 以及靶标结合亲和力和特异性高。 一种细菌可以结合多种适体, SERS信号在原位被放大, 可实现高灵敏度的检测。 研究人员已经通过基于SERS的适体和拉曼标记成功检测出金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。 Zhang^[21]、 Pang等^[22]合成了适体-Fe₃O₄@Au磁性纳米粒子(图2)作为特异性细菌富集和SERS活化底物, 万古霉素-SERS标签用于致病菌的灵敏定量。 在50 min内可以达到3个细胞/毫升的检测限。 然而, 这些策略需要繁琐的修改过程或依赖于拉曼标记。 Gao等^[23]依靠适体在细菌表面原位合成了细菌适体@AgNPs, 细菌SERS信号被其特异性识别的适体显著增强。 该方法无须标记, 检测限低至1.5 CFU· mL^-1。

图2

Fig.2

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	图2 细菌适体-AgNPs原位形成示意图[23]Fig.2 Schematic diagram of bacterial aptamer-AgNPs formation in situ[23]

免疫磁性分离技术采用初级抗体修饰的磁性纳米结构来浓缩细菌, 其将夹心型测定与磁分离相结合。 磁性纳米材料的表面积与体积比具有较高的捕获效率。 采用链霉素-亲和素级联放大系统大大提高了致病菌的检测限, 致病菌与磁性纳米粒子采用抗原抗体特异性结合所需样品量少、 检测时间短。 使用大肠杆菌抗体结合磁性金纳米粒子(Fe₃O₄@Au)对大肠杆菌进行选择性分离和富集^[24]以及计数, 该方法快速、 灵敏, 总分析时间少于70 min。 Kearns等^[25]使用凝集素功能化的磁性纳米颗粒捕获细菌[图3(a)], 然后使用菌株特异性抗体功能化SERS活性纳米颗粒特异性检测细菌[图3(b)和(c)]。 成功分离并检测出三种致病菌: 大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[图3(d)], 每种菌株的最低检测浓度仅为10¹ CFU· mL^-1。 Yuan等^[26]利用抗菌肽功能化的磁性纳米粒子以及4-巯基苯硼酸标记的Au@Ag-GO纳米复合材料成功分离大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌[图3(e)— (f)]。 此外腺苷酸修饰的Fe₃O₄纳米粒子具有高抗菌活性, 可以同时分离、 识别和杀死细菌。

图3

Fig.3

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图3 (a)凝集素(Con A)功能化的镀银磁性纳米颗粒(Ag@MNPs)与细菌结合, 磁体的存在下从样品基质中分离细菌; (b)抗体和SERS标签添加; (c)将3个AgNP缀合物与3种细菌病原体和Con A(结合所有三种细菌)一起加入, 利用532 nm激光进行分析[25]; (d)腺苷酸修饰的与样品基质(包括细菌、 血细胞或其他干扰物)一起培养; (e)Fe3O4NPs @细菌复合物与样品基质磁性分离; (f)4-巯基苯硼酸修饰的Au@Ag-GO与Fe3O4NPs @细菌复合物一起培养以形成夹层结构[26]Fig.3 (a) Agglutinin (Con A) functionalized silver-plated magnetic nanoparticles (Ag@MNPs) are combined with bacteria, and the bacteria are separated from the sample matrix in the presence of a magnet; (b) Antibody and SERS tag addition; (c) 3 AgNP conjugates are added together with 3 bacterial pathogens and Con A (combined with all three bacteria), and analyzed by 532 nm laser[25]; (d) AMP modified and The sample matrix (including bacteria, blood cells or other interfering substances) are cultured together; (e) Fe3O4NPs@bacterial complex is magnetically separated from the sample matrix; (f) 4-MPBA modified Au@Ag-GO is cultured with Fe3O4NPs@bacterial complex to form a sandwich structure[26]

微流控是在微米尺度下对微量的流体进行精准操控的一种技术, 多种微流控芯片可实现致病菌分离。 电泳可以通过施加电场使微通道中的分子和粒子产生偏移从而达到富集或分离的目的。 多电极微流控芯片施加电流时, 不同的电极组合方式会产生不同的电场分布, 实现致病菌分离。 该技术具有低成本、 便携性、 易控制、 低剂量、 响应时间短、 精度和灵敏度高等优异的特征。 Chang等^[27]开发了一种集成膜过滤和SERS 检测的微流体装置[图4(a)], 用于细菌富集、 代谢物提取和原位SERS测量。 封闭的微环境可以保证代谢物在SERS底物上稳定、 均匀的吸附。 通过比较抗生素处理前后细菌分泌的代谢物的特征拉曼信号变化可以在2 h内准确确定最低抑菌浓度, 并且不会受到细菌聚集和不均匀分布问题的影响。 Madiyar等^[28]报告了通过在微流控芯片的底部嵌入垂直排列的碳纳米纤维制成的纳米电极阵列[图4(b)和(c)], 用于有效地捕获和浓缩大肠杆菌。 然而, 这些器件存在限制了吞吐量和分离效率, 电极污染, 以及无法处理样品碎片等不足。 Honson等^[29]发明了一种非接触的介电泳-SERS器件[图4(d)], 电极通过绝缘屏障与样品通道隔离, 防止电极污染, 该器件集成了阻抗分析可以分离和捕捉细菌, 并且识别碎片。 该装置已成功地从3 μ m聚苯乙烯微球中分离出了分枝杆菌, 准确率为100%。

图4

Fig.4

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图4 (a)微流控系统及器件原理图[27]; (b) 在4倍放大下拍摄的光学显微镜图像, 显示微流体通道和中心的活性正方形[28]; (c)四个具有多项式边界的电极对称排列以及电势场分布和电泳力的曲线图[30]; (d)介电泳-SERS装置的示意图[29] 2.4 静电结合检测Fig.4 (a) Schematic diagram of the microfluidic system and device[27]; (b) Optical microscope image taken under 4X magnification showing the microfluidic channel and the active square at the center[28]; (c) The symmetrical arrangement of four electrodes with polynomial boundaries and the graphs of electric potential field distribution and electrophoretic force[30] ; (d) Schematic diagram of DEP-SERS device[29]

革兰阳性菌表面的肽聚糖和革兰阴性菌表面的脂多糖都带负电荷, 负电荷脂多糖是几种革兰氏阴性细菌的主要内毒素和外膜成分, 带负电荷的细菌表面物质成为致病菌SERS检测的生物标志物。 因此, 带正电荷的纳米粒子和带负电荷的细菌结合后, 纳米粒子在致病菌表面形成大量的SERS “ 热点” , 这种检测方法大大增加了致病菌及其耐药性的检测限。 Fang等^[31]发现带正电荷的银纳米粒子通过静电聚集在细菌壁表面, 增强的SERS信号优于标准基底负电荷银纳米粒子。 Chen等^[32]使用带正电的银纳米粒子鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(图5)。 为了进一步证明其在临床样本鉴定中的适用性, 检测52株金黄色葡萄球菌和215株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌, 该方法成功检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 Tadesse^[33]使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)合成了带正电的金纳米棒并表征了水中革兰氏阴性大肠杆菌和粘质沙雷氏菌以及革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的SERS特征。 金纳米棒和细菌之间的等离子体和静电相互作用使SERS均匀增强。 具有较高表面电荷密度的细菌表现出明显较高的SERS信号。 Qiu等^[34]制备的巯基-聚乙二醇-NH₂功能化的Au@Ag纳米棒柱状阵列可以有效地捕获带负电的致病菌。 实现了三种代表性食源性革兰氏阳性菌, 即木糖葡萄球菌、 单核细胞增生李斯特菌和屎肠球菌的高灵敏度检测。

图5

Fig.5

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	图5 (a)金黄色葡萄球菌与AgNPs-(左)、 AgNPs+(右)混合的SEM图像(b)AgNPs-或AgNPs+的金黄色葡萄球菌的SERS光谱[32]Fig.5 (a) SEM image of S.aureus mixed with AgNPs- (left), AgNPs+ (right); (b) SERS spectra of S.aureus using AgNPs- or AgNPs+[32]

多变量统计分析方法是一种传统的分析高维数据的方法, 一般通过特定的算法提取原始数据中的有效信息降低数据维度, 从而有利于后续数据分析。 主成分分析(principal component analysis, PCA)是最常用的多变量分析方法。 主成分分析通过正交变换将原始变量转换成一系列不相关的变量, 转换后的一系列变量称为主成分。 由于少量头部主成分包含了绝大部分原始数据的有效信息, 一般在分析时只截取前几个主成分, 从而降低数据维度。 Hadjigorgiou等^[36]使用SERS对肺炎克雷伯氏菌、 变形杆菌和大肠杆菌进行AST, 使用PCA结合线性判别分析和留一交叉验证区分耐药菌、 中间菌和敏感菌, 分类正确率达94%。 Premasiri等^[37]用SERS研究了两株细菌, 通过偏最小二乘判别分析区分耐药菌和敏感菌。 判别的敏感性> 95%, 特异性> 99%。 Ayala等^[38]利用SERS结合PCA和判别分析用于区分不同的种类的致病菌。 Lin等^[39]建立了一种基于SERS和层次聚类分析的大肠杆菌、 鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌耐药性快速检测方法。 对123株临床分离菌(42株大肠杆菌、 41株鲍曼不动杆菌和40株铜绿假单胞菌)进行了检测。 与微量肉汤稀释法相比, 检测灵敏度和特异性分别为90.9%和91.1%。 筛查易于进行, 可在1.5 h内完成。

机器学习通过大规模的学习训练数据集, 从而提取数据的有效特征, 建立预测模型实现高灵敏度判别分析。 传统的机器学习方法有支持向量机、 决策树、 K近邻分类算法等。 Cheong等^[15]采用多元统计学方法PCA和支持向量机来快速鉴定喹诺酮类耐药肺炎克雷伯菌(ATCC70063, ST11和ST15)。 该方法具有高重现性(相对标准偏差为7.4%)和灵敏的检测限(100 pmol· L^-1, R6G), 相关系数为0.98。 Walter等^[40]比较了支持向量机和线性判别分析区分两种不同激发波长(532和244 nm)的致病菌SERS光谱的能力。 分别实现了大约92%和90%的识别率。 Ciloglu等^[41]使用SERS结合机器学习技术快速鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和嗜肺军团菌。 K近邻分析方法在支持向量机、 决策树和朴素贝叶斯等传统分类器中具有97.8%的分类准确率。 SERS和机器学习为抗生素耐药菌的鉴别提供了一个可靠的工具。

深度学习是最先进的机器学习算法, 它从大规模的原始数据集中学习特征并直接构建预测模型。 深度学习算法有很多, 包括卷积神经网络, 完全连接的网络, 残差神经网络等。 其在挖掘数据的局部特征和提取全局训练特征方面具有良好的性能^[42], 数据分类识别的能力远超传统多变量统计分析算法^[43]。 Ho等^[44]通过训练一个卷积神经网络准确识别30种常见的细菌病原体, 即使在低信噪比谱上, 也能达到超过82%的准确率并且抗生素治疗识别准确率高达97.0%± 0.3%。 对50名患者的临床分离株进行了验证, 仅使用来自每个患者分离物的10个细菌谱, 实现了99.7%的抗生素治疗识别准确率。 Thrift等^[45]利用卷积神经网络联合SERS技术在抗生素暴露后10 min内将大肠杆菌和铜绿假单胞菌对抗生素的反应与未处理的细菌分离, 准确率大于99%。 这种无需对细菌进行培养的方法显著提高了分类精度, 可在30 min内选择有效的抗生素治疗, 这极大地减少了用常规生长试验验证表型AST所需的时间。