引用本文
邵可满, 傅桂瑜, 陈素艳, 洪诚毅, 林郑忠, 黄志勇. 稀土配合物分子印迹荧光探针的制备及检测孔雀石绿的残留[J]. 光谱学与光谱分析, 2022,42(3): 808-813.
SHAO Ke-man, FU Gui-yu, CHEN Su-yan, HONG Cheng-yi, LIN Zheng-zhong, HUANG Zhi-yong. Preparation of Molecularly Imprinted Fluorescent Probe for Rare Earth Complex and Determination of Malachite Green Residue[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2022,42(3): 808-813.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2022)03-0808-06  
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稀土配合物分子印迹荧光探针的制备及检测孔雀石绿的残留
邵可满, 傅桂瑜, 陈素艳, 洪诚毅, 林郑忠*, 黄志勇*
集美大学食品与生物工程学院, 福建 厦门 361021
*通讯作者 e-mail: linzz@jmu.edu.cn; zhyhuang@jmu.edu.cn

作者简介: 邵可满, 1998年生, 集美大学食品与生物工程学院硕士研究生 e-mail: keman105@163.com

收稿日期: 2021-03-13 接受日期: 2021-05-26
基金: 国家自然科学基金项目(21804050); 福建省科技厅项目(2018J01432); 福建省食品微生物与酶工程重点实验室项目(Z820224-3); 集美大学培育计划(ZP2020029)资助
摘要

孔雀石绿是一种人工合成的三苯甲烷类化合物。 孔雀石绿的常规检测方法前期处理复杂、 耗时长、 需要使用大型仪器等缺点导致不能及时的对其进行检测。 所以研究出一种能够高效、 便捷、 快速的检测孔雀石绿残留的方法具有十分重要的意义。 分子印迹聚合物(MIPs)是一种多孔隙材料, 具有特定的识别位点, 可以对特定的目标分子进行识别和吸附。 稀土配合物在618 nm处发射荧光, 孔雀石绿的最大吸收波长是618 nm, 二者重合产生荧光猝灭效应, 由此研究出了一种稀土配合物分子印迹荧光探针来检测水产品中的孔雀石绿的方法。 利用分子印迹技术固定稀土配合物并吸附水产品中的孔雀石绿, 通过在618 nm处检测其荧光猝灭程度来计算水产品中孔雀石绿的具体含量。 采用沉淀聚合法, 以隐性孔雀石绿为模板, 甲基丙烯酸为功能单体, 二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂, 改性二氧化硅为核, 稀土荧光配合物Eu(MAA)3Phen为荧光物质, 在模板∶单体∶交联剂=1∶4∶10, 稀土配合物为15 mg, 乙腈60 mL的条件下, 制备了一种孔雀石绿分子印迹聚合物, 通过对其进行TEM和FTIR的扫描分析验证了已经成功合成稀土配合物分子印迹, 检测荧光寿命时发现在未加入孔雀石绿前荧光寿命为1 094.11 μs, 而加入孔雀石绿后的荧光寿命为587.49 μs, 荧光寿命的减少说明孔雀石绿对MIPs的猝灭属于荧光共振能量转移FRET。 在验证MIPs的选择性和吸附性能以后, 对孔雀石绿进行检测。 结果表明, 优化条件下聚合物对孔雀石绿的线性范围为0~20 μmol·L-1, 荧光猝灭系数 F0 /F与孔雀石绿浓度呈现良好的线性关系, 线性方程为 F0 /F=1.008 c+0.344(0.1~1 μmol·L-1, R2=0.991), F0 /F=0.587 c+0.570(1~20 μmol·L-1, R2=0.999), 检出限为0.037 μmol·L-1(3 σ/S, n=9), 将其作为荧光探针成功应用于鱼肉中孔雀石绿的检测, 加标回收率在95.61%~102.51%范围。 说明研究出的稀土配合物分子印迹荧光探针可以便捷、 快速、 准确地检测出孔雀石绿的残留量。

关键词: 孔雀石绿; 稀土配合物; 分子印迹; 荧光猝灭
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Preparation of Molecularly Imprinted Fluorescent Probe for Rare Earth Complex and Determination of Malachite Green Residue
SHAO Ke-man, FU Gui-yu, CHEN Su-yan, HONG Cheng-yi, LIN Zheng-zhong*, HUANG Zhi-yong*
College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China
*Corresponding authors
Abstract

Malachite green is an artificially synthesized triphenylmethane compound. The disadvantages of conventional detection methods for malachite green, such as complicated pre-treatment, long time-consuming and requiring the use of large instruments, result in the inability to detect promptly. So it is of great importance to invent a method that can detect malachite green residue effectively, rapidly and conveniently. Molecularly Imprinted Polymers (MIPs) are multiporous materials with specific recognition sites that allow the recognition and adsorption of specific target molecules. The rare-earth complexes emit fluorescence at 618 nm, and the maximum absorption wavelength of malachite green is also 618 nm, and the combination of the two produces fluorescence quenching effect. Thereby a rare-earth complex based molecularly imprinted fluorescent probe was developed to detect malachite green in aquatic products. The specific content of malachite green in aquatic products was calculated by detecting the degree of its fluorescence quenching at 618 nm. A malachite green molecularly imprinted polymer was prepared by precipitation polymerization method using cryptic malachite green as a template, methacrylic acid as a functional monomer, ethylene dimethacrylate as a crosslinking agent, modified silica as a core, and the rare-earth fluorescent complex Eu(MAA)3phen as a fluorochrome, in the following conditions∶template∶monomer∶crosslinker=1∶4∶10, Rare earth complexes=15 mg, acetonitrile 60 mL, Molecular imprinting of rare-earth complexes, which have been successfully synthesized, was verified by carrying out TEM and FT-IR scanning analysis, and the fluorescence lifetime when examined was found to be 1 094.11 μs. However, the fluorescence lifetime after the addition of malachite green was 587.49 μs. The decrease of fluorescence lifetime illustrated that the quenching of MIPs by malachite green belonged to the fluorescence resonance energy transfer fret. After verifying the selectivity and adsorption properties of MIPs, malachite green was examined. The linear range of the optimized polymer for malachite green was 0~20 μmol·L-1, the fluorescence quenching coefficient F0 /F shows a good linear relationship with the malachite green concentration, and the linear equation is F0 /F=1.008 c+0.344(0.1~1 μmol·L-1, R2=0.991), F0 /F=0.587 c+0.570(1~20 μmol·L-1, R2=0.999) with a detection limit of 0.037μmol·L-1 (3 σ/S, N=9), which was successfully applied as a fluorescent probe for the detection of malachite green in fish meat, with spiking recoveries in the range of 95.61%~102.51%. These results indicate that the developed MIP based probes can detect malachite green residues easily, rapidly and accurately.

Keyword: Malachite green; Rare earth complex; Molecular imprinting; Fluorescence quenching
引言

孔雀石绿(MG)是一种有效的水产养殖杀菌剂和寄生性杀菌剂[1], 作为治疗真菌和原虫感染的药物, 能起到驱虫杀菌, 延长鱼类的存活时间的作用, 在水产养殖业得到广泛应用[2]。 研究发现MG具有高残留、 高毒性, 会产生致畸、 致癌、 致突变等“ 三致效应” [3]。 但由于MG价格低廉且杀菌效果好, 仍然有不少商家违法添加使用, 近年来发生了多起MG残留的食品安全事件, 因此MG的日常检测是非常有必要的。

目前常用于MG检测的方法主要有高效液相色谱法[4]、 液相色谱-质谱联用(LC-MS)[5]、 气相色谱-质谱联用(GC-MS)[6]、 以及表面增强拉曼光谱法(SERS)[7]。 虽然这几种检测方法灵敏度高、 选择性好, 但样品前处理复杂、 操作繁琐、 仪器昂贵等缺点限制了这些方法的使用。 因此寻找一种快速高效的MG检测方法仍有十分重要的意义。

分子印迹聚合物(MIPs)是一种多孔隙材料, 有特定的识别位点, 对特定的目标分子具有较强的识别功能[8]。 由于其制备简单, 具有良好的化学性能、 机械性能, 在食品分析, 化学传感器和固相萃取等方面广受人们的关注[9]。 沉淀聚合法属于非匀相溶液聚合, 聚合物不溶于溶剂中, 聚合物自发地从溶剂中沉淀出来, 得到的聚合物微球粒径小, 形态均匀, 不需要经过研磨、 过筛等特殊处理, 可避免印迹位点的丢失, 操作简便。

以硅烷偶联剂(KH570)改性的二氧化硅为核, Eu(MAA)3Phen为荧光物质, 隐形孔雀石绿(LMG)为模板, 丙烯酰胺(AM)为功能单体, 双甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)为交联剂, 2, 2’ -二偶氮异丁腈(AIBN)为引发剂, 乙腈为溶剂, 采用沉淀聚合法制备了MIP荧光微球。 这也是国内外首次用稀土配合物为荧光源制备MIP的研究报道。 采用FTIR、 荧光寿命等对荧光探针进行了表征; 考察了MIP和NIP的荧光性能、 吸附性能、 选择特异性; 考察了MIP与MG浓度的线性关系; 将制备的MIP用于水产品中MG的加标回收测定实验中。 结果表明, 制备的荧光探针具有灵敏度高、 特异性强的优点, 能实现对MG的快速检测。

1 实验部分
1.1 试剂

甲基丙烯酸(MAA)、 邻菲罗啉(Phen)、 氯霉素(CAP)、 四环素(TC)、 隐性结晶紫(LCV)、 结晶紫(CV)、 磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、 磺胺噻唑(ST)、 金氯素(CTC)、 萘啶酸(NA)、 隐色孔雀石绿(LMG)、 乙二醇二甲基丙烯酸均购于(上海阿拉丁生化科技有限公司); 氧化铕、 磺胺胍(SG)、 磺胺嘧啶(SD)均购于(上海麦克林生化科技有限公司); 孔雀石绿、 偶氮二异丁腈购于(国药集团化学试剂有限公司)。 丙烯酰胺购于(西陇化工有限公司)。 试剂均为分析纯。

1.2 仪器

瞬态/稳态荧光光谱仪(英国Horiba公司, FLS-980); 紫外-可见分光光度计(美国PerkinElmer公司, Lambda265)荧光分光光度计(美国PerkinElmer公司, LS55); 红外光谱仪(美国ThermoFisherScientific, NicoletiS10); 磁力搅拌器(大龙兴创实验仪器有限公司MS-H-Pro); 透射电子显微镜(日本电子株式会社, JEM-2100); 垂直旋转混合仪(杭州米欧仪器有限公司, VM-80)。

1.3 稀土荧光配合物Eu(MAA)3Phen的制备

稀土荧光配合物的制备参考文献[10]的做法并加以改进: 往0.35 g Eu2O3中加入20 mL浓盐酸, 加热至出现晶膜, 加入20 mL无水乙醇溶解, 得到EuCl3无水乙醇溶液。 在三口烧瓶中加入510 μ L MAA、 0.36 g Phen、 20 mL无水乙醇, 并用25%~28%氨水调节pH值约为7。 搅拌下将EuCl3无水乙醇逐滴加入, 升温至60 ℃持续搅拌反应4 h, 静置、 抽滤后用乙醇洗涤沉淀数次, 于50 ℃真空干燥8 h, 得到白色固体粉末Eu(MAA)3Phen。

1.4 MIP@SiO2@Eu(MAA)3Phen的制备

往100 mL圆底烧瓶中加入5 mL乙腈, 0.125 mmol LMG和0.75 mmol AM, 超声分散均匀后放置在4 ℃冰箱中预聚合2 h。 随后往上述溶液中加入15 mg稀土配合物, KH570处理过的SiO2微球60 mg, AIBN 50 mg和1.25 mmol交联剂EGDMA, 超声30 s混合均匀后通入N2 20 min以除去溶液中的氧气, 随后加入50 mg AIBN。 在60 ℃水浴下磁力搅拌(1 000 r· min-1)反应30 min, 后将转速调至800 r· min-1反应5.5 h。 反应结束后抽滤得到粗聚合物, 将其置于乙醇∶ 乙腈=7∶ 3 (V∶ V)混合液中索氏抽提, 直至紫外分光光度计下无LMG检出, 得到聚合物MIP, 将MIP干燥后备用。 不加入模板的分子印迹聚合物(NIP)的合成过程除不加LMG外, 其余步骤与MIP的制备一致。

1.5 荧光测试

往离心管中加入浓度为0.02 mg· L-1的配合物溶液2 000 μ L, 分别用含有MG的乙腈溶液和纯乙腈定容到2 050 μ L。 控制狭缝为10 nm, 在激发波长为270 nm下测定发射波长618 nm处的荧光强度, 计算猝灭效率F0/F, F0为未添加MG时溶液的荧光强度, F为添加了MG后溶液的荧光强度。

1.6 加标回收实验

将5 g剁碎的鱼肉加入质量分数为20%的盐酸羟胺1.5 mL和0.05 mmol· L-1的乙酸铵溶液3.5 mL, 匀浆5 min后, 取1 g匀浆液, 加入MG乙腈标准溶液, 用2 mL乙腈超声提取5 min, 于1 000 r· min-1离心5 min, 收集提取液, 重复2次, 合并两次提取液, 将提取液用N2吹干, 吹干后, 用6 mL乙腈复溶, 加入MIP, 混匀于室温下静置20 min后, 在270 nm激发波长下测定溶液的荧光强度。

2 结果与讨论
2.1 TEM

利用TEM表征了MIP, NIP和SiO2的结构和形态。 由图1可知: MIP, NIP和SiO2均呈球状结构, 从图1(c)中可以看出SiO2粒径较小, 以SiO2为核, 采用沉淀聚合法合成MG的分子印迹聚合物, 由图1(a)和(b)可以看出, MIP和NIP的粒径明显比SiO2的粒径大, 可以说明稀土配合物Eu(MAA)3Phen已负载在SiO2的表面。

图1 MIP(a), NIP(b)和SiO2(c)的透射电镜图Fig.1 TEM images of MIP(a), NIP(b) and SiO2(c)

2.2 红外光谱分析

由图2可以看出MIP和NIP具有相似的振动峰, 说明MIP中模板已基本洗脱干净。 在2 987 cm-1的C— H伸缩振动, 1 384和2 954 cm-1的C— H弯曲振动, 1 455 cm-1的C— H面内弯曲振动, 1 727和3 436 cm-1的C=O伸缩振动, 都证实了EGDMA的存在, 说明交联剂成功修饰在聚合物骨架里[11]。 1 547 cm-1为N— H面内弯曲振动, 962和799 cm-1为N— H面外弯曲振动, 1 631 cm-1为C=C振动峰, 这些证实了AM的存在[12]。 1 110 cm-1的Si— O— Si反对称伸缩振动峰, 799 cm-1的Si— O— Si对称伸缩振动, 473和800 cm-1的Si— O— Si弯曲振动, 1 630 cm-1处的硅烷偶联剂KH-570分子的O— H的弯曲振动峰, 说明聚合物成功印迹在SiO2表面[11]。 以上结果表明聚合反应成功制备出了MIP和NIP, 红外光谱研究也进一步说明了聚合物的组成与结构。

图2 MIP和NIP的红外光谱图Fig.2 FTIR spectra of MIP and NIP

2.3 荧光寿命

荧光寿命的测量在FL980-STM稳态/瞬态荧光光谱仪上进行。 测量加入10 μ mol· L-1 MG前后MIP的荧光寿命图谱, 按照式(1)进行数据拟合。

R(t)=A+∑i=1nBiexp(-t/τi)(1)

式(1)中, A为背景, R(t)是对应时间的MIP的荧光强度; τ 1和τ 2分别为MIP辐射和非辐射寿命。 B1和B2是对应的统计权重。 平均荧光寿命(τ av)根据式(2)计算。

τav=∑Biτi2∑Biτi(2)

式(2)中, τ i是测量的寿命, Bi是统计权重的数值。

荧光寿命试验结果如图3所示, MIP的荧光寿命为1 094.11 μ s, 而加入MG后荧光寿命为587.49 μ s。 荧光寿命减少说明MG对MIP的猝灭属于荧光共振能量转移FRET[13]。 这是因为MIP的荧光峰与MG的吸收峰重叠, 且两者以均相形式存在, 荧光给体和受体的距离很短, 因此可以发生显著的FRET效应。

图3 加入MG前后MIP的荧光寿命图谱Fig.3 Fluorescence lifetime mapping of MIPs before and after the addition of MG

2.4 选择性

按照1.5的实验方法, 考察在2.5 μ mol· L-1的SG, SD, SDM, CAP, TC, LCV, CV, CTC和NA乙腈溶液和MG乙腈溶液对MIP和NIP的荧光猝灭程度, 结果如图4所示。

图4 不同药物对MIP和NIP的猝灭效率(浓度为2.5 μ mol· L-1)Fig.4 Quenching efficiency of MIP and NIP by different drugs (at a concentration of 2.5 μ mol· L-1)

虽然这几种物质也能对荧光探针的荧光造成猝灭, 但猝灭程度均低于MG, 这是由于这些物质的吸收波长与荧光探针的吸收峰的位置(618 nm)有不同程度的重叠, 也能发生不同程度的荧光共振能量转移, 特别是CV的重叠程度较大。 由于NIP不存在印迹位点, CV和MG的猝灭程度相差不大, MG及其类似物的荧光均会下降; 而在MIP中, CV的猝灭程度则小于MG, 这是由于在MIP中存在能够与MG特异性结合的印迹位点。

2.5 荧光响应时间

在MIP和NIP中分别加入2.5 μ mol· L-1 MG-乙腈溶液, 考察其在不同反应时间下的荧光强度, 同时以不加MG作为对照。 由图5可以看出, 在不加入MG时, MIP和NIP的荧光强度保持相对稳定, 加2.5 μ mol· L-1MG后, MIP和NIP的荧光强度在短时间内迅速降低, 并且在20 min后趋于稳定。 因此, 实验中选择加入样品20 min后再测量荧光值。

图5 MIP和NIP的动力学曲线Fig.5 Kinetic curves of MIPs and Nips

2.6 MG标准曲线

分别测定加入MG浓度为0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9, 1, 3, 5, 7, 9, 10, 15和20 μ mol· L-1时MIP的荧光强度, 结果如图6所示。 可以看出, MIP在与MG发生荧光猝灭之后, 荧光探针的发射峰波长位置没有发生变化, 说明荧光探针与MG之间是非辐射能量转移[14]。 MG与荧光探针之间的荧光猝灭符合Stern-Volmer方程[15], F0/F=1+KSV[c]。 其中, F0表示无MG时聚合物的荧光强度; F表示加入MG后聚合物的荧光强度; KSV为猝灭效率; c为MG的浓度。

图6 MIP对MG荧光猝灭程度(插图为MIP加入MG前后在365 nm紫外灯下的荧光图Fig.6 The degree of Mg fluorescence quenching by MIPS (inset is the fluorescence plot of MIPs before and after the addition of Mg under 365 nm UV lamp)

在优化条件下, 向聚合物乙腈溶液中加入不同浓度的MG乙腈溶液, 20 min后分别测定加入MG前后的探针荧光强度, 荧光光谱如图6所示。 以猝灭效率(F0/F)和MG浓度建立标准曲线, F0/F与MG浓度呈现良好的线性关系(图7), 在低浓度下线性方程为F0/F=1.008c+0.344(0.1~1 μ mol· L-1, R2=0.991); 在高浓度下线性方程为F0/F=0.587c+0.570 (1~20 μ mol· L-1, R2=0.999)。 检出限为0.037 μ mol· L-1(3σ /S, n=9), 因此实验中所制备的聚合物MIP可用于实际样品中MG的快速检测。

图7 F0/F与MG浓度线性关系Fig.7 Linear relationship between F0/F and MG concentration

2.7 加标回收实验

将MIP用于鱼肉样品中进行加标回收实验, 实验中MG加标浓度为1, 5和10 μ mol· L-1, 回收率结果如表1所示。 可以看出, 本方法对鱼肉中MG的加标回收率在95.61%~102.51%之间, 相对偏差低于5.21%。

表1 不同方法检测鱼肉样品中MG的回收率 Table 1 Recovery of malachite green from fish meat samples detected by different methods

为了验证方法的准确性, 利用国标方法[16]对鱼肉样品进行加标检测, 回收率结果如表1所示。 可以看出两种检测法的检测结果相当, 国标方法的加标回收率在89.35%~113.51%之间, 相对偏差低于6.17%。 本方法的加标回收率说明了本方法检测鱼样中MG残留具有快速、 准确、 方便的优势。

3 结论

采用沉淀聚合法, 以稀土荧光配合物为荧光光源, 制备了一种孔雀石绿分子印迹聚合物, 该聚合物荧光发射峰在618 nm, 与MG的最大吸收波长匹配, 两者之间可以发生FRET效应, 因此配合物的荧光能被MG猝灭。 聚合物对MG的线性范围为0~20 μ mol· L-1, 线性方程为F0/F=1.008c+0.344 (0.1~1 μ mol· L-1, R2=0.991); F0/F=0.587c+0.570(1~20 μ mol· L-1, R2=0.999), 检出限为0.037 μ mol· L-1。 将其作为荧光探针应用于鱼肉中MG的检测, 加标回收率在95.61%~102.51%范围内, 本文创新性地以LMG为替代模板用于MG的检测、 首次以稀土配合物为荧光制备MG-MIP, 使荧光探针对MG的检测灵敏度进一步提高。

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