牛血清蛋白纳米金团簇基于荧光共振能量转移法灵敏检测尿酸
丛剑涵1, 罗云敬1,*, 齐小花2, 邹明强2, 孔陈晨1
1.北京工业大学环境与生命学部, 环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室, 北京 100124
2.中国检验检疫科学研究院, 北京 100123
*通讯作者 e-mail: luoyj@bjut.edu.cn

作者简介: 丛剑涵, 1993年生, 北京工业大学环境与生命学部, 环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室硕士研究生

摘要

基于纳米金团簇(AuNCs)良好的光学稳定性、 生物相容性和简单无毒的制备方法, 开发了一种具有高度选择性、 高灵敏度且可视化的尿酸(UA)传感器。 使用牛血清白蛋白(BSA)作为模板合成了BSA-AuNCs。 在尿酸氧化酶的催化下, UA产生化学计量的过氧化氢(H2O2), 导致AuNCs的荧光猝灭。 此外, 发现BSA-AuNCs在该体系模拟过氧化物酶发挥酶活性, 它可以催化产物H2O2将底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)氧化成ox-TMB, 此时BSA-AuNCs的发射光谱与ox-TMB的吸收光谱重叠, 发生了一种荧光共振能量转移(FRET)。 BSA-AuNCs作为供体将激发能量转移到受体ox-TMB, 使ox-TMB产生荧光, 同时BSA-AuNCs的荧光强度明显低于单独存在时的强度, 从而大大提高了UA检测的灵敏度。 在最佳条件下, 发现UA浓度在2~100 μmol·L-1猝灭程度线性关系良好, 线性方程为( F0- F) /F0=0.005 85 cUA+0.103 64, 线性相关系数为0.995 4, UA的检出限为0.26 μmol·L-1, 远低于正常人体UA水平的最低限(90 μmol·L-1), 同时研究了血液样本中UA的加标回收, 回收率在97.3%~104.7%, 表明了该方法在临床血样UA的检测中具有很大的应用潜力, 为进一步的临床分析提供了良好的理论依据和方法学指导。

关键词: 纳米金团簇; 尿酸; 过氧化氢; 荧光共振能量转移
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Sensitive Detection of Uric Acid Based on BSA Gold Nanoclusters by Fluorescence Energy Resonance Transfer
CONG Jian-han1, LUO Yun-jing1,*, QI Xiao-hua2, ZOU Ming-qiang2, KONG Chen-chen1
1. Beijing Key Laboratory of Environmental and Viral Oncology, Faculty of Environment and Life, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China
2. China Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China
*Corresponding author
Abstract

Based on gold nanoclusters (AuNCs) with good optical stability, biocompatibility and simple and non-toxic preparation method, this paper developed a highly selective, highly sensitive and visualized uric acid (UA) sensor. We synthesized BSA-AuNCs using bovine serum albumin (BSA) as a template. Under the catalysis of urate oxidase, UA produces stoichiometric hydrogen peroxide (H2O2), which causes the fluorescence of AuNCs to be quenched. In addition, we found that BSA-AuNCs mimic the peroxidase activity in this system, catalysing the substrate's oxidation 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) to ox-TMB by H2O2. At this time, the emission spectrum of BSA-AuNCs overlaps the absorption spectrum of ox-TMB, and a kind of fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurs. BSA-AuNCs acts as a donor to transfer the excitation energy to the acceptor ox-TMB, which makes ox-TMB produce fluorescence. At the same time, the fluorescence intensity of BSA-AuNCs is significantly lower than when it exists alone, which significantly improves the sensitivity of UA detection. Under optimum conditions, it is found that the UA concentration has an excellent linear relationship between the quenching degree of 2~100 μmol·L-1, the linear equation is ( F0- F) /F0=0.005 85 cUA+0.103 64, the linear correlation coefficient is 0.995 4, and the detection limit is 0.26 μmol·L-1, which is far below the minimum limit of normal human UA levels (90 μmol·L-1). Meanwhile, the recovery of UA in blood samples was studied, and the recovery rate was 97.3% to 104.7%, indicating that this method is effective in clinical blood samples. The detection has tremendous application potential, and provides an excellent theoretical basis and methodological guidance for further clinical analysis.

Keyword: Gold nanoclusters; Uric acid; Hydrogen peroxide; Fluorescence resonance energy transfer
引言

尿酸(uric acid, UA)是人类系统中嘌呤核苷酸代谢的最终产物, 通常存在于生物液体如血清和尿液中, 并且由于尿酸的溶解性极低, 使其易于在人体内累积[1]。 尿酸过多积累会形成固体尿酸盐, 导致诸如高尿酸血症, 痛风性急性关节炎, 肾结石和高血压等疾病, 而血清中尿酸异常低可能会引发帕金森病或多发性硬化[2, 3]。 此外, 尿酸作为一种替代性抗氧化剂, 能够清除细胞中氧自由基, 从而使其在许多生理病理和损害发生中起到潜在的神经保护作用[4]。 人体在健康的生理状态下体内尿酸的含量相对稳定, 男性150~420 μmol· L-1, 女性90~357 μmol· L-1, 但在病理状态下, 其含量会发生明显波动。 因此, 血清中尿酸的测定是临床检测中最重要的生化指标之一, 开发一种具有高度选择性, 高灵敏, 高效的尿酸检测方法具有重要意义。

目前, 尿酸的测定方法主要包括高效液相色谱, 质谱, 紫外分光光度, 电化学, 化学发光和毛细管电泳法[5, 6, 7, 8, 9, 10]。 Ma等[10]开发了一种毛细管电泳法测定体液中尿酸。 Liu等[11]通过高效液相色谱-质谱联用技术同时测定人唾液中尿酸和肌酐。 陆娟等[12]采用静电纺丝法制备了碳量子点@纳米Co3O4生物传感器检测人血清中的尿酸。 然而上述方法普遍存在繁琐的衍生、 修饰和复杂的前处理等问题, 且仪器价格昂贵、 成本高和特异性低, 限制了其在临床试验中尿酸检测的潜在应用。 作为一种新型的纳米材料, AuNCs荧光探针具有操作简单、 快速、 灵敏度高的优点。 由于其良好的光学性能, 光稳定性和生物相容性, 以及其简单且无毒的制备方法[13], 在临床样品检测中具有广阔的应用前景。

本文以BSA为模板分子成功制备了BSA-AuNCs荧光探针, 并基于尿酸酶促反应产物H2O2对BSA-AuNCs荧光探针的猝灭效应, 开发了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的超灵敏生物传感器检测尿酸。 由于强荧光的BSA-AuNCs和氧化态的ox-TMB之间有效的FRET, 使得该方法简便快速, 灵敏度高。

1 实验部分
1.1 试剂和仪器

四水合氯金酸(HAuCl4· 4H2O, 国药控股有限公司); BSA(纯度> 98%, 美国Amresco公司); H2O2(30%分析纯, 北京化工厂); TMB, UA, Urate Oxidase(纯度> 98%, 上海麦克林生化科技有限公司); NaOH, Na2HPO4, NaH2PO4, Citric acid(分析纯, 国药控股有限公司); 实验用水为超纯水(电导率> 18 MΩ · cm)。

SH-3恒温磁力搅拌器(北京金科发展公司); PHS-25数字pH计(上海精密科学仪器公司); JEM-2100 透射电子显微镜(日本); U-3010紫外-可见分光光度计(UV, HITACHI日立); F-4500 荧光分光光度计(FL, HITACHI日立); Labofuge 400R离心机(美国Thermo公司)。

1.2 基于BSA-AuNCs荧光探针的合成方法

由BSA合成的AuNCs作为生物学模板参考以前的方法[14], 将125 mg BSA加入到2.5 mL超纯水中, 于37 ℃水浴中搅拌至溶解, 在剧烈搅拌下迅速向BSA溶液中加入HAuCl4水溶液(10 mmol· L-1, 2.5 mL)混匀5 min后, 加入NaOH溶液(1 mol· L-1, 0.25 mL), 在37 ℃下温和搅拌24 h。 所得BSA-AuNCs溶液的颜色从浅黄色变为浅棕色, 最后变为深棕色。 然后, 将获得的溶液在黑暗中静置24 h, 之后倒入20 000 MWCO透析袋中透析24 h(每8 h更换一次水), 以除去未反应的小分子HAuCl4和NaOH。 将透析后的混合溶液用注射器经过0.22 μm的微孔滤膜过滤除去多余的大粒径的杂质。 最终将获得的溶液在黑暗中于4 ℃下保存。

1.3 BSA-AuNCs荧光探针的表征

荧光探针的形貌通过高分辨场发射透射电镜(TEM)进行测试。 然后分别测试探针的紫外-可见光谱和荧光光谱, 并分别确定所有测试条件在5和10 nm下的激发和发射狭缝宽度。 实验的pH值采用20 mmol· L-1柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液控制。 经37 ℃温水浴中适当温育后, 在UV和FL上分别记录紫外吸收光谱和荧光光谱以定性。

1.4 基于FRET生物传感器的建立

依次将100 μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、 700 μL 20 mmol· L-1柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)、 100 μL 5 mmol· L-1 TMB溶液和100 μL 2 mmol· L-1 H2O2溶液于1.5 mL离心管中混匀, 将混合溶液在37℃温水浴中温育15 min后, 在UV上测量ox-TMB吸收光谱, 在FL上测量荧光光谱。

1.5 H2O2的荧光猝灭检测

通过稀释H2O2(30%)至1 mol· L-1, 并用KMnO4滴定新鲜制备H2O2的原液。 根据以下步骤进行H2O2的荧光猝灭测定。 将100 μL各种浓度的H2O2引入含有100 μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、 100 μL 5 mmol· L-1 TMB溶液和700 μL柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0, 20 mmol· L-1)的混合物中, 摇匀, 并在黑暗中37 ℃下温育15 min。 最后, 在500 nm的激发波长下测量荧光强度。

1.6 荧光猝灭检测UA

配制20 mmol· L-1UA储备液, 用柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液稀释UA储备液至不同浓度, 将700 μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0, 20 mmol· L-1)、 100 μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、 100 μL 5 mmol· L-1 TMB溶液、 15 μL尿酸酶(10 mg· mL-1)和不同浓度的UA在37 ℃黑暗中温育15 min。 然后用FL以500 nm激发波长记录荧光光谱。

1.7 用该方法对血液样本进行分析

首先将血样(来自3名健康志愿者), 以3 500 r· min-1离心5 min, 去除部分沉淀物, 以消除蛋白质可能对人血清的干扰, 获得浅黄色血清。 随后, 将一定体积的上层血清样品与10 mg· mL-1的尿酸酶在37 ℃下温育10 min, 然后取100 μL上述氧化后的溶液与700 μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0, 20 mmol· L-1), 100 μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、 100 μL 5 mmol· L-1 TMB溶液混合摇匀, 在37 ℃黑暗中温育15 min。 最后, 在FL上进行血清中UA的分析。

2 结果与讨论
2.1 BSA-AuNCs荧光探针的表征

BSA-AuNCs的TEM图像如图1所示, BSA-AuNCs是单分散的, 呈圆球形且分布均匀, 最小粒径0.86 nm, 最大粒径3.00 nm, 粒径平均直径为1.86 nm。 图2显示了BSA-AuNCs的UV-Vis吸收光谱、 荧光激发和发射光谱以及HAuCl4和BSA的UV-Vis吸收光谱。 曲线1显示BSA-AuNCs在275 nm附近具有强吸收峰, 曲线2和曲线3分别是HAuCl4和BSA的UV-Vis吸收曲线, 由图2可知, 三者UV-Vis吸收光谱明显不同。 当在500 nm激发时, BSA-AuNCs发射峰出现在617 nm。 插图显示在紫外灯365 nm的激发下, 深棕色的BSA-AuNCs溶液发出强烈的红色荧光。 上述结果与文献[14, 15]相似, 表明成功地制备了BSA-AuNCs荧光探针。

图1 BSA-AuNCs的TEM; 插图为BSA-AuNCs粒径分布图Fig.1 HRTEM image of BSA-AuNCs; Inset is particle size distribution of BSA-AuNCs

图2 BSA-AuNCs(1); HAuCl4(2); BSA(3)的紫外吸收光谱; BSA-AuNCs的荧光激发光谱(4)和发射光谱(5); 插图为BSA-AuNCs在日光和365 nm紫外灯下的照片Fig.2 UV absorption spectra of BSA-AuNCs (1); HAuCl4(2); BSA (3); Fluorescence excitation spectra (4) and emission spectra (5) of BSA-AuNCs; Inset are images of BSA-AuNCs under sunlight and 365 nm light

2.2 FRET生物传感器增强荧光猝灭

BSA-AuNCs的良好稳定性归因于被模板分子完全包裹的金核的化学惰性。 从而使其在FRET中的应用成为可能, 如图3(a)所示, 在BSA-AuNCs和TMB存在下加入H2O2, 此时BSA-AuNCs显示出固有的过氧化物酶活性, 在没有BSA-AuNCs的情况下, H2O2几乎不能氧化TMB。 在654 nm处显示为无色溶液且无明显吸收[图3(a), 1], 在BSA-AuNCs-TMB[图3(a), 2]和BSA-AuNCs-H2O2[图3(a), 3]中发现了相同的结果, 然而, 当将BSA-AuNCs引入H2O2和TMB溶液中时, 它可以催化H2O2将TMB氧化为ox-TMB。 ox-TMB在654 nm处出现最大吸收光谱并且获得明显的蓝色溶液[图3(a), 4]。 如图3(b)由于BSA-AuNCs的发射光谱和ox-TMB的最大吸收光谱重叠, 证明他们之间存在FRET的可能, 插图显示, 可见光下, 在BSA-AuNCs催化下TMB被氧化前后, 颜色从无色变为蓝色。 因此, 该传感系统产生了双光信号的变化。

图3 不同组分溶液的紫外-可见吸收光谱 (1) TMB+H2O2; (2) BSA-AuNCs+TMB; (3) BSA-AuNCs+H2O2; (4) BSA-AuNCs+TMB+H2O2; 插图显示相应组分溶液的照片(a); BSA-AuNCs的发射光谱和ox-TMB的紫外吸收光谱; 插图为BSA-AuNCs催化H2O2氧化TMB前后颜色变化对比照片(b)Fig.3 UV-vis absorption spectra of different component solutions (1) TMB+H2O2; (2) BSA-AuNCs+TMB; (3) BSA-AuNCs+H2O2; (4) BSA-AuNCs+TMB+H2O2; the illustration is a picture of the corresponding component solution (a); Emission spectra of BSA-AuNCs and UV absorption spectra of ox-TMB; inset are images of the color changes before and after H2O2 oxidized TMB catalyzed by BSA-AuNCs (b)

引入TMB进行荧光检测, 当BSA-AuNCs中仅存在TMB时, 不会改变其荧光强度和吸收[图4(2)], 加入一定量H2O2时, 测量荧光值略有降低, 并能保持荧光值数小时无明显波动[图4(3)]。 然而将TMB与H2O2和BSA-AuNCs共同作用时, 其荧光强度迅速降低, 且较单独加入H2O2时显示出荧光猝灭明显增强, 这比不含TMB的H2O2样品直接检测要明显得多[图4(4)]。 这是由于BSA-AuNCs和ox-TMB之间的内部过滤作用, BSA-AuNCs和ox-TMB分别作为FRET的供体和受体, 在能量转移过程中, 受体ox-TMB在BSA-AuNCs发射区域表现出较强的吸收, 使得供体BSA-AuNCs的荧光强度被显著猝灭。 因此, 基于FRET的分析方法具有灵敏度高, 可视化等优点, 证明了这是一种超灵敏荧光传感器。

图4 不同BSA-AuNCs样品的荧光光谱
1: 仅BSA-AuNCs; 2: 含5.0 mmol· L-1 TMB的BSA-AuNCs; 3: 含2.0 mmol· L-1 H2O2的BSA-AuNCs; 4: 含5.0 mmol· L-1 TMB和2.0 mmol· L-1 H2O2的BSA-AuNCs
Fig.4 Fluorescence spectra of different BSA-AuNCs samples
1: BSA-AuNCs only; 2: BSA-AuNCs with 5.0 mmol· L-1 TMB; 3: BSA-AuNCs with 2.0 mmol· L-1 H2O2; 4: BSA-AuNCs with both 5.0 mmol· L-1 TMB and 2.0 mmol· L-1 H2O2

2.3 FRET生物传感器辅助荧光猝灭系统的优化

为了获得更高的H2O2和UA的检测灵敏度, 我们考虑了各种可能的影响因素, 包括溶液酸度、 离子强度、 培养温度和时间, 对实验条件进行了优化。

2.3.1 pH的影响

考察了不同pH的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液对BSA-AuNCs在检测中荧光强度的影响, 如图5(a), 结果表明: 当BSA-AuNCs溶液在pH(6.0~8.0)范围内对H2O2的相对强度(F0/F)略有变化, 其中F0F分别是在不存在和存在H2O2和TMB的情况下BSA-AuNCs的荧光强度, 考虑到进一步的生物学应用和最佳的检测效果, 我们选择了pH6.0作为最佳酸度。

图5 pH(a), 离子强度(b), 温度(c), 反应时间(d)对荧光的影响, 含50 μmol· L-1 H2O2, 5 mmol· L-1 TMB的BSA-AuNCsFig.5 Effects of pH (a), ionic strength (b), temperature (c) and reaction time (d) on fluorescence intensity, BSA-AuNCs containing 50 μmol· L-1 H2O2 and 5 mmol · L-1 TMB

2.3.2 离子强度的影响

离子强度是光谱检测方法中的一个重要影响因素, 在这项工作中, 我们使用NaCl来控制离子强度, 以研究荧光猝灭的效果, 如图5(b), 随NaCl浓度(0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0, 80.0, 100.0, 120.0, 150.0, 153.8 mmol· L-1)的增加, BSA-AuNCs对H2O2的荧光响应没有明显变化, 表明我们的方法可以在正常生理盐浓度中进行。

2.3.3 温度的影响

如图5(c)所示, 实验测试了温度对FRET辅助荧光猝灭系统的影响, 当温度从25 ℃上升到60 ℃时, 在25~37 ℃时, F0/F逐渐升高, 当温度到达37 ℃时, 达到最佳状态, 温度由37 ℃变化到60 ℃时, F0/F略有降低, 因此, 这里我们采用37 ℃的生理温度作为最佳检测条件。

2.3.4 反应时间的影响

在动力学研究中, 为了检测BSA-AuNCs对H2O2相对荧光强度随时间的变化, 对反应时间进行了动态检测, 如图5(d)所示, 显示在BSA-AuNCs溶液中加入TMB和H2O2后, 反应时间5~80 min呈动态猝灭, 发现荧光强度在开始的15 min内几乎呈线性且显著下降, 然后保持恒定。 因此, 采用15 min作为最佳反应时间, 与不加入TMB应用BSA-AuNCs荧光探针直接检测H2O2需70 min时相比, 大大缩短了反应时间。

在最佳条件下, 不同H2O2浓度下BSA-AuNCs的荧光强度, 如图6(a)所示, 随H2O2浓度(0, 0.02, 0.5, 2.5, 7, 9, 12, 15, 20, 25, 50, 80 μmol· L-1)的变化, BSA-AuNCs的荧光强度逐渐被猝灭, 如图6(b)所示, H2O2对BSA-AuNCs在0.5~20 μmol· L-1范围内的猝灭程度(F0-F)/F0线性相关, 线性回归方程为(F0-F)/F0=0.025 83 cH2O2+0.095 12, 线性相关系数为0.994 5。 H2O2的检出限为0.07 μmol· L-1, 表明H2O2具有较低的检测限。 比不用FRET生物传感器辅助荧光猝灭系统检测H2O2样品(检出限6.6 μmol· L-1)低近两个数量级[16]。 因此, 基于FRET的传感器具有灵敏度高, 检测限低, 可视化的优点, 大大提高了其检测性能, 为进一步灵敏地检测UA提供了基础。

图6 BSA-AuNCs对不同量的H2O2和TMB共存的荧光光谱图(a); 线性关系Stern-Volmer图(b)Fig.6 Fluorescence spectra of BSA-AuNCs with different amounts of H2O2 and TMB (a); the Stern-Volmer plot showing the linear relationship (b)

2.4 UA的检测

基于以上的检测结果, 我们已经建立了一种对H2O2的灵敏、 可视化的检测方法。 由于H2O2是一系列特定底物氧化酶的酶促反应产物, 因此H2O2的灵敏检测可以扩展到生物催化过程的应用中。 尿酸氧化酶在UA的存在下催化和氧化UA生成H2O2, 尿囊素(Allantoin)和二氧化碳(CO2)。 基于FRET法灵敏检测UA如示意图1所示。

结果显示, 当添加TMB后, 在检测UA的酶促反应产物时, 显示出荧光猝灭较UA单独存在时增强, 如图7(a)所示, 随UA浓度(0, 0.7, 2.0, 15, 40, 65, 70, 80, 100, 150, 200 μmol· L-1)的增加, BSA-AuNCs的荧光强度持续降低, 并且研究了仅向BSA-AuNCs中添加UA或尿酸氧化酶不会引起其荧光强度的变化。 而当UA和尿酸氧化酶同时存在时, BSA-AuNCs的荧光发生猝灭, 这表明BSA-AuNCs的荧光强度降低是由于尿酸氧化酶催化尿酸产生H2O2引起的。 在尿酸氧化酶存在下, 不同浓度的UA与BSA-AuNCs反应的相对强度(F0-F)/F0, 如图7(b)所示, 其中F0F分别是不存在UA和存在UA的荧光强度, 结果发现, 在2.0~100 μmol· L-1范围内, 猝灭程度呈良好线性关系, 表示为(F0-F)/F0=0.005 85cUA+0.103 64, 线性相关系数为0.995 4, 检出限为0.26 μmol· L-1。 远低于人体正常尿酸含量的最低值(90 μmol· L-1)。 因此, 设计的FRET, 灵敏传感器在检测UA方面优于以前的报道[16, 17], 显示了高灵敏度和低检测限的优势。 为其进一步应用于临床血样的检测提供了基础。

图7 BSA-AuNCs对不同量的UA和TMB共存的荧光光谱图(a); 线性关系Stern-Volmer图(b)Fig.7 Fluorescence spectra of BSA-AuNCs with different amounts of UA and TMB (a); the Stern-Volmer plot showing the linear relationship (b)

2.5 BSA-AuNCs的选择性评估

为了证明我们设计的灵敏传感器的选择性, 还研究了一些其他潜在干扰物对BSA-AuNCs的响应, 实验是在最佳检测条件和10 mg· mL-1尿酸氧化酶存在下进行的, UA的浓度为50 μmol· L-1, 干扰物质BSA, 谷胱苷肽(GSH), 抗坏血酸(Vc), 柠檬酸(CA), 尿素(Urea), 葡萄糖(Glu), 甘氨酸(Gly), 酪氨酸(Tyr), 氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)的浓度为5 mmol· L-1, 结果如图8, 上述干扰物质中仅Vc提供了较小的荧光增强, 除此之外其他物质存在下BSA-AuNCs的荧光强度几乎保持恒定, 仅当存在UA时, 荧光才显著猝灭。 这归因于尿酸氧化酶的高催化活性和对UA的高特异性, 结果表明, 所提出的灵敏UA检测方法具有高选择性。

图8 UA的潜在干扰物对BSA-AuNCs荧光探针的影响Fig.8 Effect of potential interfering compounds of UA on BSA-AuNCs fluorescent probe

图9 示意图1 BSA-AuNCs荧光探针基于FRET检测H2O2和UA的示意图
2.6 临床血液样本的分析
Fig.9 Scheme 1 Schematic diagram of BSA-AuNCs fluorescent probe detecting H2O2 and UA based on FRET

由于该方法具有的高灵敏度、 高度选择性和高特异性, 因此将本方法应用于实际临床血样中UA的测定, 结果如表1, 采用标准加样回收的方法检测血样中的UA, 加标回收率为97.3%~104.7%, 相对标准偏差RSD为2.4%~3.2%, 表明此方法可以应用于临床血液样本中UA的灵敏检测。

表1 血液样本UA回收率结果 Table 1 Results of UA recovery rate of blood samples
3 结论

以BSA作为模板分子, 以简单、 绿色的方法合成了BSA-AuNCs荧光探针, 基于超灵敏的FRET多功能生物传感系统检测H2O2和UA, BSA-AuNCs在这里显示出特征性的过氧化物酶活性, 在检测中催化H2O2氧化TMB, 从而生成ox-TMB。 强荧光的BSA-AuNCs和ox-TMB之间有效的FRET使得对H2O2和UA的检测限极低, 分别为0.07和0.26 μmol· L-1, BSA-AuNCs催化的过氧化物酶底物TMB生成ox-TMB的颜色变化可以更直观的观察到实际样品中的UA。 与之前的方法相比, 本方法操作简单, 快速, 具有较高的灵敏度和选择性且可视化, 此方法用于测定临床实际血样中UA的浓度, 获得了较为满意的结果, 有望应用于临床实际样品中UA的快速、 灵敏和高特异的检测。 本研究设计的FRET传感器在这里显示出灵敏度高, 检测限低等优点, 大大提高了UA酶促反应产物H2O2的检测性能, 使得该方法有助于实现其他特定酶促反应产物的快速筛查分析。

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