毒死蜱标准溶液购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 多菌灵标准溶液购自罗恩试剂。 根据GB 2763— 2021《食品安全国家标准食品中农药残留最大残留限量》脐橙表面毒死蜱和多菌灵国标限量分别为3和5 mg· kg^-1, 分别用甲醇溶液稀释毒死蜱和多菌灵标准溶液, 配置浓度梯度为0, 0.5, 1, 2 mg· kg^-1的毒死蜱溶液和0, 1, 3, 5 mg· kg^-1的多菌灵溶液, 置于具塞锥形瓶中备用。 实验所用的脐橙均购自超市, 挑选表面没有缺陷和损伤的脐橙, 将其表皮洗净, 静置晾干。 将配置好的溶液模拟农药喷洒至脐橙表面。

采用荧光高光谱仪(北京卓立汉光仪器有限公司)采集脐橙的荧光高光谱图像。 荧光高光谱系统主要由CCD相机、 氙灯光源、 二向分色镜、 电控位移平台、 发射光滤光片、 暗箱和控制计算机组成。 该系统覆盖了392~998.2 nm波段范围内的176个波长, 光谱分辨率为3.5 nm, 相机的分辨率为960像素× 1 101像素, 像素数(空间维× 光谱维)为960× 176。 图2为荧光高光谱系统光学原理结构图。

图2

Fig.2

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	图2 荧光高光谱系统光学原理结构图Fig.2 Optical principle structure of the fluorescence hyperspectral system

第一次采集时保留自动曝光、 自动调焦、 自动速度匹配, 点击采集可自动完成数据采集。 之后打开自动拍摄的图像查看是否过曝, 如果结果不理想则需要手动调整参数。 经过预实验, 最终确定采集荧光高光谱图像的参数为: 起点位置0.65 cm, 扫描距离1.0 cm, 扫描前进速度0.07 cm· s^-1, 回退速度0.20 cm· s^-1, CCD相机对样品的曝光时间设置为40 s, 增益为5。 激发光滤光片滤光为357 nm, 带宽为45 nm(激发光波长334.5~379.5 nm)。

荧光高光谱可以通过改变激发和发射波长来检测多种荧光基团的存在。 荧光光谱是基于不同基团有机分子的相互作用、 反应、 吸收和辐射而形成, 每个组分的荧光光谱之间存在相互影响, 因此认为光谱的变化与毒死蜱和多菌灵的浓度变化有关。 分子受荧光激发后发生激发态分子内质子转移(ESIPT), 分子构型发生四级循环变化, 即N(基态)→ N^* (激发态)→ T^* (激发态)→ T(基态)→ N(基态)变化, 如图3所示。 当样品受到氙灯光源的激发后, 电子会从基态(N)的最低振动能级跃迁至激发态(N^* )或者更高能量的激发态(T^* )。 激发态分子不稳定, 部分分子以非辐射跃迁形式释放能量, 部分分子以辐射跃迁形式回到基态(N), 这个过程为荧光发射^[15]。 产生荧光的首要条件是该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构, 通常含苯环结构和共轭大π 键。 本研究中的毒死蜱和多菌灵的分子结构如图4所示, 均具有苯环和大π 键, 理论上具有较高的荧光效率。 此外, 有机物分子溶于甲醇溶剂中将在甲醇-水二元混合溶剂中形成复杂的氢键混合物, 从而增加分子的平面性, 荧光增强。 本研究将毒死蜱和多菌灵溶液溶解于甲醇溶液, 以增强其荧光性。

图3

Fig.3

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	图3 激发态质子转移的能级模型Fig.3 Energy level models for excited state proton transfer

图4

Fig.4

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	图4 毒死蜱和多菌灵的分子结构Fig.4 Molecular structure of chlorpyrifos and carbendazim

1.4.1 光谱数据预处理

消除实验过程中相机暗电流、 光散射、 仪器的基线漂移和噪声等无关信息的影响, 提高后续模型的性能, 需要对光谱数据进行预处理。 采用的预处理方法包括卷积平滑(savitzky-golay smoothing, SG)、 标准正态变量变换(standard normal variate, SNV)和一阶导(first derivative, FD)。

高光谱数据的高维性和相邻变量之间的强相关性导致了模型训练的复杂性和高时间消耗。 特征波长变量的选择是光谱数据分析和简化模型的关键步骤, 主要集中在从大量光谱中识别和提取特征变量。 本研究采用区间变量迭代空间收缩法(iVISSA)、 无信息变量消除算法(UVE)、 竞争性自适应加权算法(CARS)^[16]和二维相关光谱(2D-COS)^[17]方法对特征波长进行了选择。

采用主成分分析与线性判别分析相结合算法(PCA-LDA)和偏最小二乘算法(PLS-DA)建立脐橙表面不同浓度毒死蜱和多菌灵残留及光谱变量的判别模型。 模型性能通过精确度评价, 精确度越高, 表示模型性能越好。

使用ENVI 4.8选取脐橙样本的整个区域作为感兴趣区域, 将感兴趣区域内所有像素的平均荧光光谱作为脐橙光谱数据进行进一步分析。 图5为采集的脐橙荧光高光谱图像。 通过对采集的荧光高光谱图像进行分析, 发现700.2~998.2 nm没有荧光成像。 因此有效发射波段为392~700.2 nm, 共94个波段。 后续数据分析及建模均基于有效波段。

图5

Fig.5

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	图5 脐橙荧光高光谱图像Fig.5 Fluorescent hyperspectral images of navel oranges

图6为脐橙表面不同浓度毒死蜱和多菌灵的平均光谱曲线。 图6(a)为毒死蜱的平均光谱曲线, 不同浓度样品的光谱曲线走势相似。 喷洒毒死蜱的脐橙荧光强度高于未喷毒死蜱的原始脐橙样本, 且随着浓度增加, 荧光强度逐步升高。 在530 nm附近出现一个微弱的谱峰, 为橙子表面橙皮素的荧光发射波长。

图6

Fig.6

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	图6 脐橙表面不同浓度毒死蜱(a)和多菌灵(b)的平均光谱曲线Fig.6 Average spectral curves of chlorpyrifos (a) and carbendazim (b) at dfferent concentrations on the surface of navel oranges

图6(b)为多菌灵的平均光谱曲线, 表面附着多菌灵的脐橙样本的荧光强度明显高于没有多菌灵附着的脐橙表面。 其中3 mg· kg^-1浓度的多菌灵平均光谱最强, 其次是1 mg· kg^-1, 5 mg· kg^-1最弱。 分析认为大部分荧光物质存在一种聚集引发猝灭的现象。 在浓度比较高的情况下激发能量会以分子间作用力形成超分子结构的形式耗散, 荧光成分可能会抑制低量子产率成分的发射^[9], 因此在较低浓度下测得的荧光量子效率反而更高。 0 mg· kg^-1的多菌灵脐橙表面由于橙皮素在530 nm附近有荧光发射峰, 表面附着多菌灵的橙皮表面在550 nm附近出现荧光发射峰, 5 mg· kg^-1浓度的发射峰尤为明显, 由此可推测550 nm处的荧光发射峰为多菌灵的发射峰。

采用3种预处理算法(SG, SNV和FD)对光谱数据进行处理。 不同预处理后的荧光光谱有一定的差异。 SG算法可以消除噪声使光谱曲线变平滑, SNV算法可以实现光谱曲线的归一化, 而导数法可以解决光谱曲线的重叠峰, 增强光谱之间的差异。 图7为毒死蜱和多菌灵预处理前后的荧光光谱曲线。

图7

Fig.7

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图7 预处理前后的毒死蜱和多菌灵荧光高光谱曲线 (a): 毒死蜱原始荧光光谱曲线; (b): SG预处理后毒死蜱光谱曲线; (c): SNV处理后毒死蜱光谱曲线; (d): FD预处理后毒死蜱光谱曲线; (e): 多灵菌原始荧光光谱曲线; (f): SG预处理后多灵菌光谱曲线; (g): SNV预处理后的多灵菌光谱曲线; (h): FD预处理后多灵菌光谱曲线Fig.7 Fluorescence hyperspectral curves of chlorpyrifos and carbendazim in the pre and post pretreatment period (a): Chlorpyrifos original flourescence spectral curve; (b): Chlorpyrif spectral curve by SG pretreatment; (c): Chlorpyrifos spectral curve by SNV pretreatment; (d): Chlorpyrifos spectral curve by FD pretreatment; (e): Carbendazim original fluorescence spectral curve; (f): Carbendazim spectral curve by SG pretreatment; (g): Spectral curve by SNV pretreatment; (h): Spectral curve by FD pretreatment

图7(a)为毒死蜱原始荧光光谱曲线, 光谱曲线受噪声影响出现若干小的尖峰, 通过SG算法预处理后得到图7(b), 有效减少了原始光谱数据背景噪声和重叠现象。 图7(c)为经过SNV算法处理得到的光谱曲线, 光谱曲线得以归一化, 但是依然存在若干小的尖峰。 图7(d)为经过FD算法处理得到的光谱曲线, 在420~430 nm处出现了两个相反的大的尖峰, 曲线缺乏规律性。 图7(e)— (h)为多菌灵原始光谱曲线和经SG, SNV, FD预处理后的荧光光谱曲线, 与毒死蜱荧光光谱数据预处理后的光谱曲线呈现相似趋势。

对原始荧光光谱数据和预处理后的荧光光谱数据建立PLS-DA和PCA-LDA模型, 结果如表1所示。 由表1可知, 毒死蜱和多菌灵荧光光谱数据经过SG预处理后建模效果均为最优, 分析认为SG预处理有效减少了噪声对数据的影响, 提高了数据的规律性。 其中, 毒死蜱荧光光谱数据经过SG处理后建立的PCA-LDA模型, 预测集正确率达到95.83%, 比原始数据建立的PCA-LDA模型高出4.16%, 建立的PLS-DA模型, 预测集正确率达到87.5%, 高于原始数据和其他预处理后所建模型效果。 多菌灵荧光光谱数据经过SG处理后建立的PLS-DA和PCA-LDA, 正确率均达到91.67%, 为最优数据集。 结合光谱曲线和建模效果, 选择SG方法对毒死蜱和多菌灵荧光光谱数据进行预处理。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同预处理方法的模型结果 Table 1 Results of model by different sample pretreatment methods 数据集 指标 模型 模型最佳 主成分数 校正集 正确率 /% 预测集 正确率 /% RS 毒死蜱 PLS-DA PCA-LDA 4 5 79.17 94.44 83.33 91.67 多菌灵 PLS-DA PCA-LDA 5 7 90.28 95.83 83.33 91.67 SG 毒死蜱 PLS-DA PCA-LDA 6 6 88.89 95.83 87.50 95.83 多菌灵 PLS-DA PCA-LDA 8 13 95.83 97.22 91.67 91.67 SNV 毒死蜱 PLS-DA PCA-LDA 4 19 73.61 83.33 54.17 58.33 多菌灵 PLS-DA PCA-LDA 6 6 94.44 94.44 87.5 83.33 FD 毒死蜱 PLS-DA PCA-LDA 5 12 91.67 79.17 62.5 62.5 多菌灵 PLS-DA PCA-LDA 4 20 90.28 90.28 87.5 75.00

表1 不同预处理方法的模型结果 Table 1 Results of model by different sample pretreatment methods

2.3.1 特征波长一次提取与建模

使用iVISSA, CARS和UVE算法提取特征波长。 iVISSA法提取特征波长具体参数设置为: 最大主成分数为15, 交叉验证次数为15次, 选择中心化数据处理模式, 二进制矩阵的采样次数为500次。 CARS法提取特征波长具体参数设置为: 最大主成分数为15, 交叉验证次数为15次, 数据处理采用中心化数据处理模式, 蒙特卡罗采样次数为500次。 UVE法提取特征波长具体参数设置为: 最大主成分数为30, 交叉验证次数为5次, 选择中心化数据处理模式, 二进制矩阵的采样次数500次。 特征波长提取如图8所示。 图8(a)为毒死蜱荧光光谱数据的特征波长提取结果, iVISSA, CARS和UVE提取的特征波长数量分别为: 26, 10和12。 图8(b)为多菌灵荧光光谱数据的特征波长提取结果, iVISSA, CARS和UVE提取的特征波长数量分别为: 20, 30和13。

图8

Fig.8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 特征波长提取结果 (a): 毒死蜱; (b): 多菌灵Fig.8 Results of characteristic wavelengths extracting (a): Chlorpyrifos; (b): Carbendazim

对三种方法提取的特征波长建立模型, 模型结果如表2所示。 对于不同浓度的毒死蜱荧光光谱数据, iVISSA法提取的特征波长建立的的模型效果最优, PLS-DA模型的校正集和预测集正确率分别为88.89%和87.50%。 PCA-LDA模型的校正集和预测集的正确率分别为97.22%和91.67%, 均优于其他特征波长模型。 对于不同浓度的多菌灵荧光光谱数据, CARS法提取的特征波长建立的模型效果最好, PLS-DA和PCA-LDA模型预测集的正确率分别为91.67%和95.83%, 优于全波段和其他特征波长模型。 分析认为, 相较于其他方法, CARS法提取的波长多分布在500~600 nm波段范围, 对应于橙子表面的橙皮素和可能为多菌灵的发射峰出现的位置。 但是由表2可知, 毒死蜱和多菌灵的最优特征波长的波长数分别为26和30, 波长数较多, 且毒死蜱最优特征波长建立的PCA-LDA的预测集正确率略低于基于全波段建模的预测集正确率, 故采用组合算法提取特征波长, 以提取最优特征波长, 减少特征波长数量和数据冗余, 同时提高模型性能。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同特征波长的模型结果 Table 2 Results of model by different characteristic wavelength 特征波长 提取方法 指标 波长 数量 模型 模型最佳 主成分数 校正集 正确率 /% 预测集 正确率 /% iVISSA 毒死蜱 26 PLS-DA PCA-LDA 6 6 88.89 97.22 87.50 91.67 多菌灵 20 PLS-DA PCA-LDA 5 7 88.89 98.61 87.50 87.50 CARS 毒死蜱 10 PLS-DA PCA-LDA 3 6 77.78 93.06 66.67 91.67 多菌灵 30 PLS-DA PCA-LDA 14 17 94.44 97.22 91.67 95.83 UVE 毒死蜱 12 PLS-DA PCA-LDA 4 4 81.94 94.44 75.00 87.50 多菌灵 13 PLS-DA PCA-LDA 5 4 88.89 88.89 91.67 83.33

表2 不同特征波长的模型结果 Table 2 Results of model by different characteristic wavelength

2.3.2 基于组合算法的特征波长提取与建模

毒死蜱和多菌灵具有成分复杂, 含量高的特点, 特征峰存在严重重叠。 通过2.3.1得到毒死蜱和多菌灵荧光光谱数据的最优特征波长, 分别为iVISSA和CARS法。 经过二维荧光相关光谱技术进行二次提取, 可以提高光谱的分辨率和解释能力, 同时区分特征光谱中的覆盖峰、 弱峰和迁移峰。 通过表征每个特征变量在模型中的作用, 进而用于特征峰提取, 达到数据降维的目的。

如图9(a— d)分别为毒死蜱和多菌灵的同步二维荧光相关谱和三维立体图。 根据Noda的二维光谱理论, 同步二维荧光相关光谱呈对角线对称, 存在两种相关峰。 位于对角线上的峰为自峰, 呈现正值, 由动态信号自身相关得到, 其强度代表了体系对外扰的敏感程度。 图9(a)和(b)分别为毒死蜱同步二维荧光相关谱和三维立体图, 在对角线位置主要出现3个自相关峰, 分别位于458.8, 494.5和580.5 nm, 表明该变量处光谱信号对外扰较敏感。 位于对角线外的峰为交叉峰, 有正负之分, 表示相应吸收峰之间的相关程度。 在(458.8, 494.5), (494.5, 580.5)和(458.8, 580.5) nm处有明显的正交叉峰, 说明458.8, 494.5和580.5 nm处的吸收峰强度在同时同向变化。 图9(c)和(d)分别为多菌灵同步二维荧光相关谱和三维立体图, 在对角线位置主要出现3个自相关峰, 分别位于442.8, 468.5和570.5 nm。 在(442.8, 468.5), (468.5, 570.5)和(442.8, 570.5) nm处有明显的正交叉峰。 因此选择在交叉峰和自相关峰附近的波段为特征波段, 在此基础上选择了毒死蜱iVISSA-2D-COS的10个特征变量, 多菌灵CARS-2D-COS的12个变量, 作为组合算法的特征变量。 图10为经2D-COS二次提取特征波长的结果。

图9

Fig.9

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图9 毒死蜱(a, b)和多菌灵(c, d)的同步二维荧光相关谱和三维立体图Fig.9 Synchronous two-dimensional fluorescence correlation spectra and three-dimensional stereograms of chlorpyrifos (a, b) and carbendazim (c, d)

图10

Fig.10

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图10 特征波长二次提取结果 (a): 毒死蜱; (b): 多灵菌Fig.10 Results of characteristic wavelengths secondary extracting (a): Chlorpyrifos; (b): Carbendazim

表3为经过2D-COS二次提取特征波长建模结果。 对于毒死蜱的荧光光谱数据, 基于iVISSA-2D-COS与基于iVISSA建立的PLS-DA模型的预测集正确率一样, 均为87.50%, 但是二次提取后特征波长的数量减少为一次提取的50%, 减少了数据处理量, 提高了模型处理的效率; 建立的PCA-LDA模型的预测集正确率比一次提取建立的模型提高了4.16%。 对于多菌灵的荧光光谱数据, 经过2D-COS二次提取特征波长建立的PLS-DA模型和PCA-LDA模型的预测集正确率与基于一次提取特征波长所建立的模型相等, 但是特征波长数量为CARS法提取的43%。 综上所述, 对于不同浓度毒死蜱, iVISSA-2D-COS-PCA-LDA模型效果最优; 对于不同浓度多菌灵, CARS-2D-COS-PCA-LDA模型效果最优。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 二次提取特征波长建模结果 Table 3 Results of model by characteristic wavelengths secondary extracting 指标 特征波长 提取方法 波长 数量 模型 模型最 佳主成 分数 校正集 正确率 /% 预测集 正确率 /% 毒死蜱 iVISSA-2D-COS 10 PLS-DA PCA-LDA 6 8 88.89 98.61 87.50 95.83 多菌灵 CARS-2D-COS 12 PLS-DA PCA-LDA 5 3 94.44 97.22 91.67 95.83

表3 二次提取特征波长建模结果 Table 3 Results of model by characteristic wavelengths secondary extracting