氧化反应调控的金纳米簇“关-开”型荧光探针检测过氧化氢和葡萄糖
欧丽娟1,*, 李京1, 张超群1, 罗建新1, 韦吉1, 王海波2,*, 张春燕1
1.湖南工学院材料科学与工程学院, 湖南 衡阳 421002
2.信阳师范学院化学化工学院, 河南 信阳 464000
*通讯作者 e-mail: 179355188@qq.com; wanghaibohn@163.com

作者简介: 欧丽娟, 女, 1983年生, 湖南工学院材料科学与工程学院教授 e-mail: 179355188@qq.com

摘要

基于过氧化氢(H2O2)氧化单巯基(—S)为双巯基(S—S), 抑制金纳米簇(AuNCs)荧光猝灭, 建立了一种灵敏的荧光传感方法用于过氧化氢和葡萄糖(Glu)的检测。 DNA为模板合成的金纳米簇作为荧光探针, 荧光强度高、 稳定且合成简单快速。 加入半胱氨酸(Cys), 半胱氨酸上的单巯基可以与金纳米簇发生化学键合反应形成稳定的Au—S键, 破坏金纳米簇的结构, 导致金纳米簇荧光强度猝灭。 但当体系中存在过氧化氢时, 将单巯基半胱氨酸氧化成双巯基的胱氨酸。 双巯基的胱氨酸不能与金纳米簇发生键合作用, 金纳米簇在471 nm处发射出强烈的荧光信号。 葡萄糖可以在葡萄糖氧化酶(Gox)的作用下产生过氧化氢, 利用该方法进一步开展了对葡萄糖的检测。 以金纳米簇荧光强度的变化值 F/F0为纵坐标, 过氧化氢或葡萄糖浓度为横坐标, 实现了对过氧化氢和葡萄糖的灵敏检测, 线性范围分别为10~100和10~200 μmol·L-1, 检测下限分别为2.8和3.1 μmol·L-1。 选择4种其他糖类化合物和5种金属离子作为干扰物质, 均不会抑制半胱氨酸对金纳米簇的荧光猝灭效应, 表明该方法具有很好的选择性。 用该方法成功检测了胎牛血清样品中的葡萄糖, 加标回收率为94.5%~112.7%。 此外, 该方法可拓展到其他基于酶催化产生过氧化氢体系的分析物检测, 如胆固醇、 辣根过氧化物酶等, 为过氧化氢相关反应的分析提供了一种通用、 简便的方法, 在临床诊断、 食品科学和环境分析等领域具有潜在的应用价值。

关键词: 金纳米簇; 氧化反应调控; 荧光法; 过氧化氢; 葡萄糖
中图分类号:O653 文献标识码:A
Redox-Controlled Turn-on Fluorescence Sensor for H2O2 and Glucose Using DNA-Template Gold Nanoclusters
OU Li-juan1,*, LI Jing1, ZHANG Chao-qun1, LUO Jian-xin1, WEI Ji1, WANG Hai-bo2,*, ZHANG Chun-yan1
1. School of Material Science and Engineering, Hunan Institute of Technology, Hengyang 421002, China
2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, China
*Corresponding authors
Abstract

A novel turn-on sensitive fluorescent assay was proposed for H2O2 and glucose based on H2O2 oxidation of thiols to disulfides inhibiting the quenching of AuNCs with highly fluorescent emission. As a fluorescence probe, gold nanoclusters (AuNCs) have exhibited outstanding properties, such as superior fluorescence properties, excellent stability and facile synthesis. Cysteine with free —SH group could interact with AuNCs through Au-S bonds, leading to the fluorescence quenching of AuNCs. After adding H2O2, cysteine was oxidized to cystine with disulfide bonds. The thiols’ effect between cysteine and AuNCs was prevented, and obvious fluorescence emissions of AuNCs at 471 nm could be observed. Moreover, it was known that GOx could specifically catalyze glucose to generate H2O2 in the presence of oxygen. Therefore, fluorescent glucose detection could be achieved through the oxidase-catalyzed producing H2O2. Utilizing the variation of fluorescence intensity F/F0 as abscissa, H2O2 or glucose concentration as ordinate, a sensitive, selective, simple and fast analysis method for H2O2 and glucose was constructed. A linear relationship was observed from 10 to 100 μmol·L-1 for H2O2, 10 to 200 μmol·L-1 for glucose, with the detection limit of 2.8 and 3.1 μmol·L-1, respectively. Four other carbohydrates and five metal ions were selected as the interferent. All of them could not inhibit the Au-S bonding reaction triggered quenching effect, which revealed the high selectivity of the sensor towards glucose. In addition, the strategy was successfully applied for the detection of glucose in FBS samples with satisfactory recoveries from 94.5%~112.7%. Moreover, the present sensing system could be easily broadened to detect multi-analytes (cholesterol, horseradish peroxidase) based on oxidase-catalyzed producing H2O2. Therefore, the method may offer a new clinical diagnosis and food analysis platform.

Key words: Gold nanoclusters; Redox-controlled; Fluorescence; H2O2; Glucose
引言

过氧化氢(H2O2)是生物体系中非常重要的含活性氧的小分子化合物。 它能调节细胞的增殖、 分化等多种生理过程, 对生物体的平衡至关重要。 此外, H2O2是织物纤维的高效漂白剂和医疗、 环境消毒剂。 但是高浓度的H2O2会导致细胞老化, 进而对人体组织、 器官造成损伤, 引发多种疾病, 如人体衰老、 阿尔兹海默症等[1]。 因此, H2O2的日常检测非常必要。 葡萄糖是一种可被葡萄糖氧化酶(GOx)氧化产生H2O2的糖。 它不仅是活细胞的主要能量来源, 也是动植物循环过程中的代谢中间体[2]。 葡萄糖水平异常是某些疾病的指标, 如糖尿病或低血糖。 因此, 开发高灵敏、 简单的葡萄糖分析方法对预防或延缓糖尿病及其并发症如胆道炎、 中风等具有重要意义。

金纳米簇(AuNCs)作为一种典型的贵金属纳米簇, 具有合成简单、 稳定性好、 荧光性质优异和生物相容性良好等突出的性能, 在生物传感应用中备受青睐[3, 4, 5]。 半胱氨酸(Cys)是一种硫醇功能化合物, 其强烈的Au— S键合, 常被选择为AuNCs的猝灭剂[6, 7]。 此外, H2O2可氧化半胱氨酸成二硫化合物, 且该氧化反应具有较高的特异性和敏感性, 可用于构建过氧化氢相关的生物传感方法[8, 9]

本研究建立了一种基于H2O2调控AuNCs荧光的简便、 灵敏的“ 关-开” 策略用于H2O2和葡萄糖检测(图1)。 制备的AuNCs具有明显的荧光发射。 Cys存在下, Au— S键的形成有效的猝灭AuNCs荧光。 而H2O2的加入将Cys氧化成二硫键的胱氨酸。 二硫键的形成抑制了Au— S键合反应引发的猝灭效应, AuNCs发射出强烈的荧光信号。 此外, GOx可以在氧气存在下特异性催化葡萄糖生成H2O2[10]。 因此, 通过GOx催化葡萄糖生成H2O2可以实现对葡萄糖的检测。 更重要的是, 该方法具有高度的通用性, 无需调整方法的复杂性, 即可检测其他酶催化产生过氧化氢体系的分析物检测。

图1 荧光“ 关-开” 策略检测H2O2和葡萄糖的原理Fig.1 Schematic of the fluorescence turn-on strategy for H2O2 and glucose

1 实验部分
1.1 试剂与仪器

A15寡聚核苷酸链购于上海生工生物工程公司。 氯金酸(HAuCl4)、 半胱氨酸(Cys)、 葡萄糖(Glu)、 葡萄糖氧化酶(GOx)、 胎牛血清(FBS)均购于上海阿拉丁生化科技有限公司。 过氧化氢(H2O2)、 柠檬酸钠、 木糖(Xyl)、 蔗糖(Suc)、 乳糖(Mal)由上海麦克林生化科技有限公司提供。 试剂均为分析纯, 水为超纯水(电阻大于18. 25 MΩ )。

荧光分光光度计(美国安捷伦公司, Cary Eclipse)。 台式高速冷冻离心机(长沙东旺实验仪器有限公司, TG20KR)。 酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司, PHS-3C)。

1.2 荧光金纳米簇的合成

参照文献[11], 将600 nmol· L-1的A15寡聚核苷酸链与2 mmol· L-1柠檬酸钠(pH 6.0)、 50 μ mol· L-1 HAuCl4溶液混合, 在85 ℃反应30 min, 得到金纳米簇荧光探针, 置于4 ℃冰箱中避光保存备用。

1.3 过氧化氢和葡萄糖的检测

在50 μ L 10 mmol· L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中, 加入不同浓度的过氧化氢或葡萄糖/GOx (6 μ g· mL-1)和4 μ mol· L-1半胱氨酸, 混合均匀后37 ℃反应15 min。 再加入50 μ L金纳米簇, 室温下反应10 min。 290 nm激发波长下, 400~560 nm波长范围内扫描荧光发射光谱。

2 结果与讨论
2.1 方法的可行性

如图2所示, 金纳米簇的最大荧光发射波长为471 nm(曲线a), 加入4 μ mol· L-1的半胱氨酸后, 最大荧光发射波长的荧光强度迅速降低, 86%的荧光强度被有效的猝灭(曲线b)。 分析认为半胱氨酸的巯基(— S)与金纳米簇结合形成稳定的Au— S键, 猝灭了金纳米簇的荧光。 在体系中引入H2O2后, 金纳米簇在471 nm处出现了较强的的荧光发射(曲线c)。 众所周知, H2O2是一种强氧化剂, 可以猝灭金纳米簇的荧光。 实验展开了单独的H2O2对金纳米簇荧光影响的对照实验。 从曲线d可知, 100 μ mol· L-1 H2O2的加入会使金纳米簇荧光强度降低。 然而, 在体系中加入半胱氨酸和H2O2(曲线c)的荧光强度明显高于单独的H2O2(曲线d), 表明H2O2成功地将半胱氨酸中的单巯基— S氧化为双巯基S— S的胱氨酸。 没有单巯基可以与金纳米簇发生化学键合反应, 金纳米簇呈现出明显的荧光信号。 以上结果表明, 利用H2O2氧化半胱氨酸调控金纳米簇荧光强度的变化检测H2O2和葡萄糖的方法是可行的。

图2 不同体系的AuNCs的荧光发射光谱图AuNCs (a); AuNCs+Cys (b); (Cys+H2O2)+AuNCs (c); H2O2+AuNCs (d)
Concentration: A15, 600 nmol· L-1; Cys, 4 μ mol· L-1; H2O2 100 μ mol· L-1
Fig.2 Fluorescence emission spectra of AuNCs (a); AuNCs+Cys (b); (Cys+H2O2)+AuNCs (c); H2O2+AuNCs (d)
Concentration: A15, 600 nmol· L-1; Cys, 4 μ mol· L-1; H2O2 100 μ mol· L-1

2.2 实验条件优化

考察了不同实验条件: 半胱氨酸浓度、 H2O2与半胱氨酸反应时间, AuNCs与胱氨酸反应时间对传感器性能的影响。

由图3(a)可知, 随着半胱氨酸浓度的增加, 信背比F/F0(FF0分别表示H2O2存在和不存在时金纳米簇的荧光强度)逐渐增强。 当Cys的浓度高于4.0 μ mol· L-1时, 信背比反而降低。 分析认为随着半胱氨酸浓度的增加, 半胱氨酸对AuNCs的猝灭效率提高。 然而过量的Cys不能被H2O2氧化, 其对AuNCs的荧光强度效应仍然存在, 导致最终的信背比变小。 因此选择4.0 μ mol· L-1为Cys的最佳浓度。

图3 (a)半胱氨酸浓度的优化; (b)H2O2与半胱氨酸反应时间的优化; (c)AuNCs与胱氨酸反应时间的优化Fig.3 Effects of (a) Cys concentration, (b) the reaction time between Cys and H2O2, (c) the incubation time of AuNCs to oxidation product on the fluorescence response of the sensor

图3(b)是H2O2与半胱氨酸反应时间对检测体系的影响。 理论上, 时间越长, H2O2氧化半胱氨酸为胱氨酸的反应进行得越完全。 但是, 实验发现长的反应时间增加了背景的荧光强度, 导致信背比降低。 故选取15 min作为H2O2与半胱氨酸的反应时间。

实验还考察了金纳米簇与氧化产物(胱氨酸)反应所需的时间。 实验发现, 反应时间的变化对信号荧光强度F无影响, 分析认为胱氨酸不能与AuNCs结合。 另外, 半胱氨酸与AuNCs之间的猝灭反应非常迅速, 1 min内荧光强度F0急剧下降, 5 min后荧光强度F0下降缓慢。 因此, 随着反应时间的延长, 信背比F/F0基本保持不变[图3(c)]。 为了保证完全的猝灭反应, 选取10 min作为AuNCs与胱氨酸的反应时间。

2.3 传感器的分析性能

在优化的实验条件下, 探究了本方法对过氧化氢和葡萄糖检测的分析性能。 随着过氧化氢[图4(a)]和葡萄糖[图5(a)]浓度的增加, 金纳米簇在471 nm处的荧光发射峰逐渐增强。 金属纳米簇的荧光强度增值(F/F0)与过氧化氢浓度在10~100 μ mol· L-1范围内呈良好的线性关系[图4(b)], 用空白的三倍标准偏差原则计算检出限为2.8 μ mol· L-1。 葡萄糖浓度在10~200 μ mol· L-1范围内与金纳米簇荧光增值呈线性关系[图5(b)], 检出限为3.1 μ mol· L-1。 该方法检测过氧化氢和葡萄糖的灵敏度可与其他基于纳米材料的光学生物传感技术相媲美, 同时本方法更快速, 操作简单, 成本低廉[12, 13, 14, 15]

图4 (a)不同H2O2浓度对应的荧光发射光谱图(从下至上: 0, 1, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 500 μ mol· L-1); (b)荧光强度与H2O2浓度的线性关系; 插图: 校正曲线Fig.4 (a) Fluorescence emission of AuNCs upon adding various concentrations of H2O2 (0, 1, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 500 μ mol· L-1), (b) Linear relations between F/F0 and H2O2, Inset: calibration curve

图5 (a)不同葡萄糖浓度对应的荧光发射光谱图(从下至上: 0, 10, 40, 60, 80, 100, 140, 200, 400 μ mol· L-1); (b)荧光强度与葡萄糖浓度的线性关系; 插图: 校正曲线Fig.5 A fluorescence emission of AuNCs upon adding various concentrations of glucose (0, 10, 40, 60, 80, 100, 140, 200, 400 μ mol· L-1); (b) Linear relations between F/F0 and glucose, Inset: calibration curve

选取木糖、 蔗糖、 麦芽糖、 乳糖4种糖类化合物和K+, Fe3+, Zn2+, Ca2+, Mg2+ 5种金属离子作为干扰物质, 考察了该方法的选择性。 如图6所示, 干扰物质的加入, 不影响半胱氨酸对金纳米簇的荧光猝灭; 而加入葡萄糖后, 金纳米簇才有显著的荧光强度, 说明本方法对葡萄糖具有高度的选择性。

图6 选择性考察Fig.6 Relative emission intensity of different interferent in the proposed detection method

用该方法检测了胎牛血清中的葡萄糖。 将胎牛血清样品预先用蒸馏水稀释10倍, 并加入不同浓度的葡萄糖标准溶液实验结果见表1。 测得的加标回收率在94.5%~112.7%之间, 相对标准偏差(RSD)小于3.5%, 表明该方法具有检测实际样品中葡萄糖的潜能。

表1 FBS中葡萄糖检测的加标回收率 Table 1 Determinations of glucose in FBS samples
3 结论

采用荧光性能优异且稳定的金纳米簇为报告探针, 半胱氨酸作为猝灭剂, 建立了一种氧化反应调控金纳米簇荧光的“ 关-开” 型传感方法用于过氧化氢和葡萄糖的检测。 在金纳米簇中加入半胱氨酸, 半胱氨酸与金纳米簇的S-Au键合作用导致荧光猝灭。 在过氧化氢/葡萄糖(GOx)存在下, 半胱氨酸被氧化为胱氨酸。 双巯基的胱氨酸不能猝灭金纳米簇的荧光, 体系中呈现出强烈的荧光发射。 通过金纳米簇荧光强度的变化, 实现了对过氧化氢和葡萄糖的简单、 快速、 高灵敏性和高选择性检测, 检出限分别为2.8和3.1 μ mol· L-1。 同时, 该策略成功地应用于FBS中葡萄糖的检测, 在实际环境样品分析中具有潜在的应用前景。 本方法可扩展到其他可产生过氧化氢体系的目标物检测等, 为生物分析和生物传感提供新的研究思路。

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