FluoroMax-4型荧光光谱仪(法国HORIBA Jobin Yvon公司); 2450型紫外-分光光度计(日本岛津公司); Nicolet 5700型傅里叶红外光谱仪(美国热电公司); SUPRA 55型场发射扫描电子显微镜(德国卡尔蔡司有限公司)。

氢氧化钠(NaOH)、 无水乙醇(C₂H₅OH)、 环己烷(C₆H₁₂)、 六水氯化钇(YCl₃· 6H₂O)、 六水氯化镱(YbCl₃· 6H₂O)、 六水氯化铒(ErCl₃· 6H₂O)、 油酸(OA)、 1-十八烯(ODE)、 甲醇(CH₃OH)、 氟化铵(NH₄F)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(sulfo-NHS)、 二甲基亚砜(DMSO)均购于阿拉丁化学试剂有限公司; 氩气(Ar₂)购于福州华鑫达气体有限公司; 聚丙烯酸(PAA)、 一缩二乙二醇(DEG)、 甲苯(C₇H₈)、 氯化钠(NaCl)、 氯化钾(KCl)、 氯化镁(MgCl₂)均购于国药集团化学试剂有限公司; SDM适配体(序列: NH₂-GAG GGC AAC GAG TGT TTA TAG A-3)、 黑洞猝灭剂cDNA-BHQ1(序列: 5'-CGT TGC CCT C-BHQ1)均购于上海生工生物工程股份有限公司, 无特殊说明, 试剂纯度为分析纯。

实验所用水为超纯水, 所用缓冲液配制: 20 mmol· L^-1 Tris-HCl, 50 mmol· L^-1 NaCl, 5 mmol· L^-1 KCl, 5 mmol· L^-1 MgCl₂, pH 8.0。

根据文献[11]合成了PAA-UCNPs, 并做了少量修改: 将0.78 mmol的YCl₃· 6H₂O、 0.2 mmol的YbCl₃· 6H₂O和0.02 mmol的ErCl₃· 6H₂O加入至100 mL三口烧瓶中, 再加入21 mL的OA/ODE为6∶ 15的溶液, 通入氩气后在磁力搅拌下缓慢升温至110 ℃除水10 min, 然后加热至160 ℃保温30 min, 直到稀土氯化盐完全溶解。 冷却后加入10 mL溶有4 mmol NH₄F和2.5 mmol NaOH的甲醇, 于50 ℃保温30 min, 再升温至80 ℃除去甲醇溶液, 然后将混合溶液快速加热到300 ℃下保温1.5 h。 加入乙醇沉降后, 离心收集得到OA-UCNPs纳米粒子。

在100 mL三口瓶中加入200 mg的PAA, 再倒入30 mL的DEG, 将混合物加热至110 ℃, 形成澄清溶液。 缓慢加入分散有50 mg 的OA-UCNPs纳米晶体的2 mL甲苯溶液, 并在氩气保护下将温度升高至130 ℃保持10 min除去甲苯, 然后将溶液升高至一定温度回流保温一段时间。 反应完后将所得溶液冷却至室温, 并加入0.2 mol· L^-1的NaCl溶液以使粒子沉淀。 最后将粒子离心出来, 得到PAA-UCNPs。

将200 μ L EDC(0.2 mol· L^-1)和400 μ L sulfo-NHS(0.2 mol· L^-1)添加到2.5 mL含有4 mg PAA-UCNPs的DMSO中。 将10 μ L 100 μ mol· L^-1的适配体加到该分散液中, 并在室温下搅拌18 h。 将分散液离心并用DMSO洗涤两次以去除未结合的适配体, 然后分散在4 mL的Tris缓冲液中。

分别向浓度为0.5 mg· mL^-1 的Apt-UCNPs溶液中加入不同浓度的cDNA-BHQ1(2.5, 5, 7.5, 10, 15 μ mol· L^-1), 于30 ℃下孵育过夜, 然后在980 nm激发光下测试其荧光强度。

分别向分散在Tris缓冲液中的Apt-UCNPs加入不同浓度的SDM(150, 300, 600, 1000 ng· mL^-1), 于30 ℃孵育3 h, 然后分别加入cDNA-BHQ1, 继续孵育3 h, 并在980 nm激发光下测试其荧光强度。 为了考察Apt-UCNPs对SDM的特异性识别作用, 在不改变其他实验条件的情况下, 将SDM替换成磺胺醋酰和磺胺吡啶, 并在980 nm激发光下测试其荧光强度。

2.1.1 UCNPs与PAA-UCNPs的表征

对PAA(图1a)、 OA-UCNPs(图1b)与PAA-UCNPs(图1c)进行了红外光谱分析。 从图中可以看到, 由于油酸的存在, 2 925和2 856 cm^-1处对应于油酸链— CH₂的对称和不对称伸缩振动峰, 在1 561和1 456 cm^-1出现的红外峰, 被确定为— COO— 的对称和不对称伸缩振动^[12], 而1 110 cm^-1处的峰则对应于羧基的C— O伸缩振动峰。 在PAA配体交换后, 3 400 cm^-1附近的宽带表征了PAA中羧基的O— H强伸缩振动, 2 925和2 856 cm^-1对应于油酸基团的峰强度变小, 且于1 722 cm^-1处出现了新的峰, 属于PAA的-C=O伸缩振动, 并且1 110 cm^-1对应于羧基C— O的峰强度也随之增强。 根据这些实验结果, 推测可能已经完成了PAA对OA-UCNPs的交换配体改性。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 PAA, OA-UCNPs和PAA-UCNPs的红外光谱图 a: PAA; b: OA-UCNPs; c: PAA-UCNPsFig.1 FTIR spectra of PAA, OA-UCNPs and PAA-UCNPs a: PAA; b: OA-UCNPs; c: PAA-UCNPs

对OA-UCNPs[图2(a)]和PAA-UCNPs[图2(b)]进行了扫描电镜测试。 从图中可以看出, PAA修饰前分散在环己烷中的OA-UCNPs尺寸约为31 nm, 而PAA修饰后分散在水溶液中的UCNPs直径约为49 nm。 这可能是由于长链的PAA分子体积比油酸分子大, 因此包覆在UCNPs表面会使其尺寸增加, PAA的修饰使得UCNPs具有较好的水分散性, 良好的水分散性及经过PAA改性后UCNPs表面带有的基团为后续的应用提供了条件。

图2

Fig.2

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	图2 OA-UCNPs (a)和PAA-UCNPs (b)的扫描电镜图Fig.2 SEM images of OA-UCNPs (a) and PAA-UCNPs (b)

2.1.2 Apt-UCNPs的表征

为了验证适配体已经结合至PAA-UCNPs表面, 分别测试了PAA-UCNPs、 Apt-UCNPs和Aptamer在220~400 nm范围内的紫外吸收光谱, 结果如图3所示。 从图3可以看出, Aptamer在260 nm附近有一个吸收峰, 为适配体的特征吸收。 而PAA-UCNPs的曲线在该范围内无明显吸收峰, 与适配体反应后所得的Apt-UCNPs于260 nm处也出现了较明显的吸收峰, 这个峰可以归属于适配体的特征吸收, 证明了SDM适配体已偶联到UCNPs上。

图3

Fig.3

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	图3 Aptamer, PAA-UCNPs和Apt-UCNPs的紫外吸收光谱图Fig.3 UV-Vis absorption spectra of Aptamer, PAA-UCNPs and Apt-UCNPs

Apt-UCNPs用于检测SDM的机理如图4所示。 上转换纳米粒子用作产生信号的能量供体, BHQ1用作接收信号的能量受体, 适配体用作识别剂。 在没有SDM的情况下, Apt-UCNPs表面的适配体链和带有猝灭荧光基团的互补DNA(cDNA)由于碱基互补配对原则互相结合, 使BHQ1与Apt-UCNPs的距离很近^[13], 从而进行荧光猝灭, 而当环境中存在SDM时, 适配体优先与其结合, 导致cDNA-BHQ1远离Apt-UCNPs, 使得Apt-UCNPs的荧光恢复。 根据Apt-UCNPs荧光的恢复程度可以用于定量检测SDM的浓度。

图4

Fig.4

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	图4 Apt-UCNPs用于检测SDM的机理图Fig.4 Schematic diagram of Apt-UCNPs used to detect SDM

为了证实检测方案的可行性, 考察了SDM的检测机理, 由图5可知Apt-UCNPs在540 nm处有明显发射峰, 使其在980 nm激发光下肉眼可见明显绿光, 并且发射峰与BHQ1的吸收峰重叠, 这表示Apt-UCNPs上的能量通过共振能量转移效应转移到BHQ1上是具有可行性的^[14], 而Apt-UCNPs位于660 nm处的发射峰与BHQ1的吸收峰几乎没有重叠, 所以BHQ1对660 nm处的荧光发射影响很小。

图5

Fig.5

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	图5 Apt-UCNPs的荧光光谱和cDNA-BHQ1的吸收光谱Fig.5 Fluorescence spectra of Apt-UCNPs and absorption spectra of cDNA-BHQ1

为使检测条件达到最优, 优化了检测体系中猝灭剂的浓度。 在相同浓度的Apt-UCNPs中加入不同浓度cDNA-BHQ1, 孵育一段时间后, 使用980 nm的激发光分别检测其荧光强度, 并考察cDNA-BHQ1浓度对Apt-UCNPs荧光猝灭的影响。 如图6(a)可知, 随着cDNA-BHQ1浓度的增大, Apt-UCNPs位于540 nm处的发射峰强度不断减小, 而660 nm处的峰变化不大; 反之, Apt-UCNPs的荧光猝灭效率随着cDNA-BHQ1浓度的增加而增加[图6(b)]。 当cDNA-BHQ1浓度达到15 μ mol· L^-1时, 荧光强度猝灭达55%, 此时猝灭效率的趋势已经逐渐平缓, 这可能是由于UCNPs表面的适配体已基本与cDNA-BHQ1结合, 因此继续增加cDNA-BHQ1的量对其荧光强度的猝灭效果减小。 综合上述原因, 选用浓度为15 μ mol· L^-1的cDNA-BHQ1进行后续的实验。

图6

Fig.6

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	图6 不同cDNA-BHQ1浓度下的Apt-UCNPs的(a)荧光光谱和(b)猝灭效率Fig.6 (a) Fluorescence spectra and (b) quenching efficiency of Apt-UCNPs at different concentrations of cDNA-BHQ1

2.3.1 检测体系用于SDM的识别

考察了传感器检测SDM的灵敏度, 其结果如图7(a)所示, 在一定的浓度范围内(150~1 000 ng· mL^-1), SDM的浓度与Apt-UCNPs位于540 nm处发射峰的强度为正相关。 根据540 nm处Apt-UCNPs荧光强度的恢复程度, 得到相对荧光强度(F-F₀)/F₀与SDM浓度的线性关系, 其结果如图7(b)所示, 其中F₀和F分别代表不存在和存在SDM情况下Apt-UCNPs的荧光强度。 从图中可以看出, SDM的浓度与相对荧光强度在150~1 000 ng· mL^-1范围内具有较好的线性关系, 线性相关系数拟合结果为R²=0.917 28。

图7

Fig.7

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	图7 不同浓度SDM下Apt-UCNPs的(a)荧光光谱和(b)标准曲线Fig.7 (a) Fluorescence spectra and (b) standard curve of Apt-UCNPs under different concentrations of SDM system

2.3.2 特异性分析

选取了与SDM结构相似的磺胺吡啶和磺胺醋酰作为对照实验测试Apt-UCNPs的特异性识别功能, 结果如图8所示, 尽管磺胺吡啶和磺胺醋酰的浓度达到了500 ng· mL^-1, 体系中的荧光强度恢复仍然较少, 分析认为SDM适配体对SDM的高度亲和力, 能阻止Apt-UCNPs与cDNA-BHQ1之间FRET的发生, 而对其他结构类似物, 适配体的亲和力相对较低, 因此荧光强度变化较小, 证明了Apt-UCNPs传感器对SDM具有较高的特异性识别作用。

图8

Fig.8

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	图8 存在不同物质时Apt-UCNPs的荧光光谱Fig.8 Fluorescence spectra of Apt-UCNPs in the presence of different substances