试验所需原料主要为猪、 奶牛粪水(包括尿液及冲洗废水)和活性污泥。 其中, 粪水分别取自本研究团队长期定位监测的规模化生猪养殖场和奶牛养殖场的粪水收集池, 活性泥取自监测猪场的沼气发酵罐排出的污泥。 试验原料基本理化性质详见表1。 活性污泥需在实验室经中温[(35± 1) ℃]驯化至甲烷含量高于55%后使用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 发酵原料的基本理化性质 Table 1 Basic characteristics of the raw materials 指标 猪粪水 奶牛粪水 接种污泥 pH 7.5± 0.1 8.8± 0.1 8.2± 0.1 TS/% 32.7± 0.3 15.4± 0.7 3.5± 0.3 VS/% 71.2± 2.6 66.8± 1.2 53.1± 0.5 TOC/(g· kg-1 DW) 371.3± 3.7 383.7± 19.6 321.1± 7.6 TN/(g· kg-1 DW) 25.5± 0.1 13.1± 0.4 23.4± 0.3 C/N比 14.6 29.3 13.7 注: 平均值± 标准误(n=3); TS, VS, TOC和TN分别表示总固体、 挥发性固体、 总有机碳和总氮; DW表示干重。 下同 Note: Mean± standard errors (n=3); TS, VS, TOC and TN represent the total solid, volatile solid, total organic carbon and total nitrogen, respectively; DW represents the dry weight. The same below.

表1 发酵原料的基本理化性质 Table 1 Basic characteristics of the raw materials

厌氧发酵试验在180 mL血清瓶中进行。 设置4个处理组(表2), 分别为TS为4%和8%的猪、 奶牛粪水, 并接种30%(W/W)的驯化活性污泥; 同时设置仅加入接种污泥和蒸馏水的对照组。 每个处理设置3个重复(n=3)。 装料后立即通入高纯N₂吹扫5 min, 以确保瓶内厌氧环境, 然后密封。 将密封的血清瓶放置于恒温水浴锅[(35± 1) ℃]中进行厌氧发酵试验。 每天定时手动摇匀物料两次, 随后测定日产气量, 并取样分析CH₄含量。 当各个处理的日产气量低于累积产气量的1%时, 反应终止。 整个发酵试验共计34 d。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 试验处理中发酵原料的配比 Table 2 The raw material ratios in the experimental treatments 处理代码 原料类型 TS/% 质量/g 原料 污泥 蒸馏水 PM1 猪粪水 4.0 15.4 37.8 72.8 PM2 猪粪水 8.0 30.8 37.8 57.4 DM1 奶牛粪水 4.0 32.8 37.8 55.4 DM2 奶牛粪水 8.0 65.6 37.8 22.6

表2 试验处理中发酵原料的配比 Table 2 The raw material ratios in the experimental treatments

试验结束后, 称量沼液质量, 并充分混匀后取样。 所得沼液样品在9 000 r· min^-1下离心10 min, 上清液经0.45 μm滤膜过滤后得到DOM溶液。

日产气量采用排水法测定, 甲烷含量采用气相色谱仪(GC9890B, 南京仁华色谱科技应用开发中心)测定。 DOM浓度采用TOC仪(MultiN/C3100 TOC/TN, 德国耶拿分析仪器有限公司)测定, 各处理的DOM含量均为扣除对照组后得到的数据。 3DEEM特征采用荧光光谱仪(FS5, 天美科学仪器有限公司)测量, 为避免浓度差异对荧光强度结果的影响, 首先将提取的DOM溶液的总有机碳(TOC)浓度统一稀释至(10± 0.1) mg· L^-1。 激发波长(Ex)为230~500 nm, 步长为2 nm; 发射波长(Em)为250~600 nm, 步长为1 nm。 扫描速度为1 200 nm· min^-1。 所有样品均在室温下测定, 采用超纯水为空白进行背景扣除以消除拉曼散射峰。

沼液中DOM质量(以干重计)的计算公式为

M=c×m0×TS(1)

式(1)中, M为DOM的质量, mg; c为DOM的浓度, mg· g^-1; m₀为物料总质量, g; TS为总固体含量, %。

腐殖化指数(humification Index, HIX)的计算公式为

HIX=∫(EM435~480)dEx/∫(Em300~345)dEx(2)

式(2)中, ∫(Em435~480)dEx为Ex在254 nm, Em在435~480 nm处荧光强度值的积分; ∫(Em300~345)dEx为Ex在254 nm, Em在300~345 nm时荧光强度值的积分^[7]。

原料及沼液DOM荧光组分的定量分析采用MATLAB 2016R v.和DOMFluor工具箱, 实现DOM组分的PARAFAC模型建立和验证。 利用残差分析与半分法确定最优组分数并检验PARAFAC模型的准确性, 最终确定荧光组分的荧光峰位置和强度, 每个成分的荧光强度用F_max(RU, 拉曼单位)表示^[10], 用以表征各成分相对浓度的估计值。

各指标在不同处理间的差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 多重比较采用最小显著性差异(LSD)法, α =0.05; 同一处理在发酵前后各指标的差异性分析采用独立样本T检验法。 统计分析软件为SPSS 26.0 v., 图形绘制软件为Origin 2018 v.。

猪、 奶牛粪水中温厌氧发酵过程中日产气量、 甲烷含量变化分别如图1(a, b)所示。 总体看来, 各处理组的日产气量在发酵初期逐渐升高, 并在发酵后期不断下降。 猪、 奶牛粪水在中温厌氧发酵过程中, 甲烷含量在试验前期缓慢上升, 分别在第12 d和第4 d达到峰值, 后期分别稳定在61%和54%左右。 发酵累积产气量达238.0~484.8 mL· g^-1 VS, 这与团队前期利用相同原料进行中温厌氧发酵的研究结果基本一致^[11]。 产气结果说明, 该厌氧发酵试验运行正常, 所得沼液具有代表性。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 猪、 奶牛粪水发酵过程中日产气量(a)和甲烷含量(b)的变化特征 注: 平均值± 标准误(n=3)Fig.1 Changes of gas productivity (a) and methane concentration (b) during the anaerobic digestion of pig and dairy manure slurries Note: mean± standard errors (n=3)

猪、 奶牛粪水中温厌氧发酵前后DOM的含量变化如图2所示。 产气结束后各试验组的DOM含量下降, 在PM1, PM2, DM1和DM2处理中降幅分别为84.55%, 73.47%, 71.78%和61.44%, 降幅均达到极显著(p< 0.001)水平。 分析认为随着厌氧发酵反应的进行, 原料中的DOM不断被微生物降解转化, 以CH₄和CO₂等气体形式排出发酵体系。 此外, 厌氧发酵结束后, 沼液中干物质含量的降低也导致了这一变化。

图2

Fig.2

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图2 猪、 奶牛粪水发酵前后DOM含量变化特征 注: 不同大、 小写字母分别表示处理中原料和沼液的差异显著(p< 0.05); * * * 表示同一处理发酵前后差异显著(p< 0.001), 下同。Fig.2 Changes of DOM content in the raw and digested pig and dairy manure slurries Note: Different capital and small letters indicate the significant (p< 0.05) differences between the treatments in raw and digested materials, respectively; * * * indicate significant (p< 0.001) differences between the raw and digested materials. The same below.

根据Ex和Em波长的不同, 可将3DEEM图划为5个区域^[12], 分别代表类胡敏酸、 可溶性微生物副产物、 类富里酸、 类色氨酸和类酪氨酸, 详见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 EEM的荧光峰划分及归属 Table 3 Fluorescence peak division and attribution of EEM in the raw and digested manure slurries 归属 标号 Ex/nm Em/nm 类胡敏酸 A 250~400 380~500 可溶性微生物副产物 B 250~400 280~380 类富里酸 C 220~250 380~450 类色氨酸 D 220~250 330~380 类酪氨酸 E 220~250 280~330

表3 EEM的荧光峰划分及归属 Table 3 Fluorescence peak division and attribution of EEM in the raw and digested manure slurries

不同浓度的猪、 奶牛粪水发酵前后的3DEEM如图3所示, 其差异反映了DOM在发酵前后的演变。 各试验组沼液中, 3DEEM的最高荧光强度始终出现在区域B, 说明微生物副产物是原料和沼液的主要组成部分, 此外还含有胡敏酸、 富里酸和少量蛋白质类物质。 但沼液中区域B的荧光强度均有不同程度的下降趋势, 这主要是由于原料中含量较多的可溶性微生物副产物等易降解物质, 在发酵过程中被微生物利用并降解转化, 因此发酵结束后荧光强度明显降解。 不同发酵浓度的沼液中DOM各组分亦有所差异, 主要表现在: PM2[图3(b)]和DM2[图3(d)]试验组沼液中, 区域C的荧光强度呈现明显的上升趋势, 说明厌氧发酵过程中有部分类富里酸物质生成; 而PM1[图3(a)]和DM1[图3(c)]处理组沼液中, 荧光区域C的荧光强度变化不明显。 各处理组沼液中区域D、 E的荧光强度差异不明显, 说明类色氨酸和类酪氨酸对不同发酵原料和发酵浓度的响应不敏感。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 猪、 奶牛粪水(a) PM1; (b) PM2; (c) DM1; (d): DM2发酵前后DOM三维荧光光谱图变化特征Fig.3 3DEEM changes of DOM in the raw and digested pig of (a) PM1; (b) PM2; (c) DM1; (d): DM2

2.4.1 荧光组分解析

由于单个峰位置对物理化学条件的变化较为敏感, 因此仅依据EEM光谱来评估DOM的成分可能会出现偏差。 PARAFAC法可以降低一些荧光峰重叠, 提高对荧光数据分析的准确性, 进一步表征DOM不同组分的含量变化^[13]。

对本研究中沼液的3DEEM进行PARAFAC分析, 共解析出4个荧光组分[图4(a)], 即: C1(主峰Ex/Em=275/300 nm、 次峰Ex/Em=225/300 nm)归属为类酪氨酸物质^[14]; C2(Ex/Em=275/430 nm)归属为类富里酸组分; C3(主峰Ex/Em=275/350 nm、 次峰Ex/Em=225/350 nm)归属为类色氨酸组分; C4(Ex/Em=225/450 nm)归属为类胡敏酸组分^[7]。 其中, C1和C3为可溶性微生物副产物组分, 它们主要由微生物活动产生, 属于游离态或蛋白质类的结合态氨基酸; C2和C4为类腐殖质组分, 芳香族结构较丰富、 分子量较大、 分子结构较复杂, 难被微生物降解^[7]。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 猪、 奶牛粪水发酵前后DOM的PARAFAC荧光组分(a)及Fmax(b)变化特征Fig.4 PARAFAC fluorescence components (a) and Fmax (b) of DOM in the raw and digested pig and dairy manure slurries

2.4.2 荧光组分的相对含量

原料及沼液中DOM的PARAFAC荧光组分的F_max变化如图4(b)所示。 与原料相比, 沼液DOM中可溶性微生物副产物(C1、 C3)的相对含量均呈显著(p< 0.05)下降, PM1, PM2, DM1, DM2中C1和C3的相对含量分别下降了98.01%, 38.11%, 58.94%和60.27%。 PM1和DM1处理中沼液的DOM中类富里酸组分(C2)的降幅分别为12.63%和13.93%, 而PM2和DM2处理中沼液的C2组分却提高了113.71%和2.00%。 分析认为由于PM1和DM1处理中发酵原料浓度低, 反应底物不足, 微生物分解和腐化程度不高, 故富里酸的产生量降低; 而PM2和DM2处理中发酵原料充足, 微生物分解和腐化程度高, 故富里酸产生量增加。 PM1, PM2, DM1和DM2处理中沼液的类胡敏酸组分(C4)的相对含量分别增加33.43%, 194.07%, 30.39%和62.24%。 说明, 厌氧微生物可将易利用的有机物分解成小分子单体, 通过聚合作用向更稳定的胡敏酸、 富里酸转化, 腐殖化程度提高^[15]。 与其他处理相比, 只有PM2处理中沼液的4个组分总量高于发酵原料, 这主要是C2和C4组分明显增加所导致, 同时也说明高发酵浓度的猪粪沼液中腐殖化程度更高。

2.4.3 腐殖化指数

通常情况下, HIX(腐质化指数)与物料的芳香化程度密切相关。 PM1, PM2, DM1和DM2处理中沼液DOM的HIX均极显著(p< 0.001)提高(图5), 增幅分别为115.99%, 180.77%, 52.53%和89.01%。 这说明猪、 奶牛粪沼液中DOM的芳香化程度明显提高。 沼液中DOM腐殖化程度的增加对于沼液还田后土壤质量的提升及污染物的钝化/降解可能产生积极效应^[8]。

图5

Fig.5

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	图5 猪、 奶牛粪水发酵前后DOM腐殖化指数变化特征 注: * * 和* * * 表示同一处理发酵前后差异显著(p< 0.01, p< 0.001)Fig.5 Changes of DOM humification index in the raw and digested pig and dairy manure slurries Note: * * and * * * indicate significant (p< 0.01, p< 0.001) differences between the raw and digested pig and dairy manure slurries, respectively