Tetraphenylporphyrin(TPP)在艾览(上海)化工科技有限公司购买, tetra(4-carboxypheyl)porphyrin(TCPP)在北京伊诺凯科技有限公司购买, tetra(4-aminophenyl)porphyrin(TAPP)在天津希恩思生化科技有限公司购买。 这些分子的结构如图1所示。 所有样品没有经过任何前处理。 为在串联质谱实验中得到稳定的离子信号, 对不同样品的溶液配比及浓度进行了优化。 TPP以10 μ mol· mL^-1的浓度溶解在配比为二氯甲烷:乙酸=98:2的溶液中; TCPP以5 μ mol· mL^-1的浓度溶解在配比为甲醇:乙酸=98:2的溶液中; TAPP以1 μ mol· mL^-1的浓度溶解在配比为二氯甲烷:甲醇:乙酸=49:49:2的溶液中。

图1

Fig.1

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	图1 三种不同取代基的卟啉类化合物 (a): 4苯基卟啉; (b): 四对羧基苯基卟啉; (c): 四对氨基苯基卟啉Fig.1 Three species porphyrins compounds with different substituents (a): TPP; (b): TCPP; (c): TAPP

所使用的装置已在之前的工作中做出过较详细的说明^{[2, 11, 12]}, 在此只做简单说明。 如图2所示, 光解离光谱使用一台7.0 T傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪结合两台可调谐激光器获得。 电喷雾离子源(ESI)的探针电压设置在2.8 kV用于将样品电离。 2台可调谐激光器被集成在系统之中: 第一台为桌面式可调谐OPO(EKSPLA, NT-342C, 立陶宛), 其输出的激光可调谐范围为192~2 600 nm; 另一台可调谐激光器为可产生2 600~3 700 nm红外激光的桌面式OPO(Msquared Firefly-IR, 英国)。 目标离子使用“ Stored Waveform Inverse Fourior Transform” (SWIFT)的方法进行选择。 紫外-可见激光(单脉冲能量约为1~1.5 mJ, 实验在210~700 nm波段内进行扫描)的光路与ICR分析池同轴, 穿过一个CaF₂窗口法兰被引入到ICR分析池中用以光解离实验。 两台激光器的光路可通过改变光学真空腔内其所对应反射镜的位置进行切换^[11]。 激光照射时间为2 s使用一个机械快门(Sigma-Koki, 日本)进行控制, 其控制信号由FT-ICR质谱仪的内部时序提供。 实验数据全部通过自主开发的程序进行控制而获得。

图2

Fig.2

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	图2 实验装置Fig.2 A Picture of the experimental setup

AutoMS程序由彼此独立的两个部分所组成。 第一部分AutoSpecMS用于自动数据采集; 第二部分AutoDataMS用于自动数据分析。 两部分程序可以彼此独立运行。

AutoSpecMS使用Python语言进行编写, 是一种面向对象编译的脚本语言。 其所需要解决的关键问题是在Windows操作系统下将三台产自不同厂商的商业仪器有序地集成在一起, 并自动地获取光解离质谱与光谱数据。 三台商业仪器分别为7.0 T IonSpec FT-ICR质谱仪、 EKSPLA NT-342C 可调谐OPO(激光覆盖范围192~2 600 nm)以及Msquared Firefly可调谐OPO(激光覆盖范围2 500~3 700 nm)。 为解决上述问题, 两台激光器和一台质谱仪分别抽象化成类(class)对象OPO_NT, OPO_Firefly和FT_MS。 当在主程序中调用它们时, 分别进行实例化, 从而实现控制。 在与商业仪器进行通讯的过程中, 主要采用Python语言的pywin32扩展库及selenium扩展库, 分别实现NT-342C激光器控制软件, 傅里叶变换离子回旋共振质谱仪控制软件及Firefly-IR激光器网页控制软件的通讯。

AutoSpecMS程序的流程图如图3(a)所示, 在此做以简要说明:

图3

Fig.3

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	图3 程序流程图 (a): AutoSpecMS; (b): AutoDataMSFig.3 Software design flow charts (a): AutoSpecMS; (b): AutoDataMS

(1) 用户设置采集光谱的波长范围(a₁, a₂), 并初始化变量i的值为a₁;

(2) 判断i的值是否小于a₂, 若小于a₂, 则执行步骤(3), 否则执行步骤(9);

(3) 与激光器建立通讯, 并实现控制;

(4) 设置激光器波长的值为i nm;

(5) 与7.0 TFT ICR MS 建立通讯, 并实现控制;

(6) 采集波长i nm下的光解离碎片离子质谱图;

(7) 以特定的文件名称自动保存步骤(6)中采集的质谱图至用户指定的文件夹;

(8) 更改i的值, 令i=i+1, 并执行步骤(2);

(9) 关闭激光器, 结束数据采集。

AutoSpecMS程序可以根据用户的需要自动采集大量串联质谱数据。 例如, 如果需要获取某些分子在211~710 nm波段, 扫描步长为1 nm的紫外-可见光解离光谱, 需要采集总共500张高分辨质谱。 如果实验需要在每个波长下重复3次以获得实验的误差阈值, 那么总共的质谱采集数据则为1 500张。 不同于其他质谱仪, FTICR质谱仪的数据量大, 计算机处理速度是比较慢的。 而这样大量的高分辨质谱数据的分析需要耗费巨大的人力。 同时在长时间的重复实验当中, 人为引入的错误很难被发现。 因此对数据进行自动化分析是不可或缺的。 程序的第二部分AutoDataMS就是为了达到此目的而设计的, 这部分程序使用MATLAB进行编写, 其程序流程如图3(b)所示, 主要的步骤为:

(1) 用户设置源文件路径, 光谱强度数据保存的路径及文件名, 信噪比, 采集光谱的波长范围(a₁, a₂), 并初始化变量i的值为a₁;

(2) 判断i的值是否小于a₂, 若小于a₂, 则执行步骤(3), 否则执行步骤(9);

(3) 对i nm的时域质谱信号数据进行快速傅里叶(FFT)变换, 得到质荷比对应强度信息的质谱图;

(4) 对步骤(3)得到的质谱图进行噪声信号的评定;

(5) 获取i nm质谱图中满足信噪比要求的碎片离子强度值;

(6) 根据式(1)算出i nm目标离子的光谱强度值

Int=∑IfIp+∑If(1)

式(1)中I_f表示碎片离子的强度值, I_p表示母体离子的强度值;

(7) 保存i nm质谱图中的碎片离子强度值以及光谱强度值;

(8) 更改i 的值, 令i=i+1并执行步骤(2);

(9) 绘制光谱图, 结束数据处理。

为了使用户便于操作, 实现数据分析过程的可视化, 本研究使用MATLAB的GUI编程语言进行了人机交互界面的编写。 如图4所示, 人机交互界面被分为参数设置区、 功能区和结果显示区。 图中左侧部分为参数设置模块, 包括源文件名称、 质荷比范围、 激光扫描范围、 扫描步长、 信噪比阈值、 母离子质荷比、 质谱仪采样频率以及输出文件名等。 图中右侧区域为用于结果的展示模块, 将数据可视化的展现给用户, 方便用户浏览实验结果。 图中以一个3D光谱为例, 作为展示结果, 实验波长扫描范围为210~700nm, 质荷比范围为m/z 400~630。 其中所有的质谱和光解离光谱数据都可以被保存成为常规数据文件, 方便使用其他分析软件进行下一步处理, 比如Origin或Excel。

图4

Fig.4

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	图4 AutoDataMS程序界面Fig.4 The interface of the AutoDataMS program

为证明上述软件程序的可行性, 选取了几种卟啉衍生物分子, 开展了光解离质谱和光谱实验。 作为一类大共轭体系的分子, 卟啉类分子在集光、 能量、 电子转移反应和催化等方面有着非常重要的作用, 并受到广泛关注。 卟啉及其衍生物分子具有很强的光吸收和光致发光性质, 其分子结构及化学性质也被众多专家、 学者所研究^[13]。 例如, Seo等利用离子迁移质谱仪结合红外多光子解离光谱的方法研究了Protoporphyrin IX早期聚合物的结构等性质^[14]。 Chen等使用177 nm纯固态深紫外激光发现TPPs的电离能可达7.0 eV^[15]。 Jä ger等使用一台商业FT-ICR质谱仪(Bruker Apex Ⅱ )结合一台纳秒脉冲OPO, 研究了不同种类M(Ⅱ )-meso-tetra-(4-sulfonatophenyl)-porphyrin (M=Pd, Cu和Zn)化合物在410~650 nm波段内的“ action” 光谱^[16]。

实验中, 波长扫描范围为210~700 nm, 扫描步长为2 nm。 利用AutoSpecMS实现了质谱数据的自动获取和保存。 在FT-ICR质谱上采集每张光解离质谱图所需要的时间大概为13s, 每种化合物的光解离光谱实验在无人为干预的情况下可在1 h内完成。

图5展示了质子化的TPP, TCPP和TAPP紫外-可见波段的光解离光谱。 三种化合物的离子在420~460 nm波段内都出现了较明显的吸收。 TCPP的吸收在紫外波段内的吸收最强, 且吸收带也是最宽的, 其余两种化合物在此波段内的吸收与TCPP相比较弱。 在500~650 nm波段内, TPP和TCPP都有很强的吸收, 但是TCPP的吸收带要明显窄于TPP, 然而TAPP与另外两种化合物相比在此波段内只可观察到很弱的吸收。 由实验光谱可得出结论, 卟啉类分子的紫外-可见光谱可因其取代基不同而进行区分。

图5

Fig.5

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	图5 三种不同离子的紫外-可见光谱 (a): 质子化TPP; (b): 质子化TCPP; (c): 质子化TAPP 所有光谱在210~700 nm波段内扫描, 扫描步长2 nm; 数据使用AutoSpecMS程序自动采集Fig.5 UV-Vis action spectra of three different ions (a): Protonated TPP; (b): Protonated TCPP; (c): Protonated TAPP All Spectra are acquired in the range from 210~700 nm and a step of 2 nm. The data were collected by the AutoSpecMS program automatically

进一步观察三种化合物在433和550 nm处的光解离质谱[如图6(a— f)所示], 发现三种化合物在这两个波长的激光照射下都有很多不同的光解离通道。 需要说明的是, 以图6(a)为例, 图中可看到解离峰都是由一簇峰组成, 每簇离子峰由其同位素峰以及-H峰及-2H峰组成。 由于图中的空间有限, 其他图中的离子峰簇仅指认出最强的离子峰。 每个被指认出的碎片离子峰使用其对应的符号及其所对应的质荷比进行标识。 图6(a)和(d)分别为TPP在433和550 nm激光照射下的光解离质谱。 为使所展示出的质谱图易于解读, 不同的解离碎片使用不同的图形符号来代替, 其注释被标注在图6的顶端。 图中两个波长下的光解离质谱, 可以明显地显示出其光谱中所对应的强吸收, 这些碎片离子包括很多自由基离子。 图6(b)和(e)为TCPP的光解离质谱, 可以明显看出其在433 nm处的光解离碎片从离子强度和种类, 数量上皆大于TPP。 而对于质子化的TAPP, 在433 nm处可观察到很强的碎片离子且强度较大, 但当激光调谐到550 nm时, 只可观察到较弱的碎片离子。

图6

Fig.6

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	图6 三种离子在不同波长激光照射下的光解离质谱 (a), (b)和(c)分别为质子化TPP, TCPP和TAPP在433 nm激光照射下采集; (d), (e)和(f)为别为三者在550 nm激光照射下采集Fig.6 Photodissociation mass spectra of selected ions obtained at different wavelengths (a), (b) and (c) are the mass spectra of protonated TPP, TCPP and TAPP obtained with laser irradiation at 433 nm, while (d), (e) and (f) are ones obtained with laser at 550 nm, respectively

本文所述的软件程序不仅可获得目标离子的光解离光谱, 同时也可以获得单通道的光解离碎片离子产率谱。 碎片离子产率谱既反映了单个光解离碎片离子随激光波长变化的强度变化, 又反映了相应的解离通道对总光谱的贡献。 图7显示了这三种化合物的某些光碎片离子的单通道光谱。

图7

Fig.7

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图7 三种不同质子化离子光解离碎片产率光谱 (a): 质子化TPP的m/z 538光碎片; (b): 质子化TCPP的m/z 670(红色)光碎片及m/z 745(黑色)碎片; (c): 质子化TAPP的m/z 583(红色)光碎片及m/z 658(黑色)碎片Fig.7 Yield spectra of different fragment ions from different parent ions (a): Fragment ion of m/z 538 from the protonated TPP; (b): Fragment ions of m/z 670 (in red) and m/z 745 (in black) from the protonated TCPP; (c): Fragment ions of m/z 583 (in red) and m/z 658 (in black) from the protonated TAPP

除此之外, 如图4所示的3D紫外-可见光谱也能以2D的形式展现出来。 图8为所涉及的三种卟啉衍生物分子的2D光谱, 可以直接地展示出光碎片的质荷比以及对应的激光波长。 由于在紫外-可见光解离实验中, 母离子的强度始终高于其他光碎片离子, 因此一条对应母离子强度的较明显的黄色带始终可被观察到。 对于图8(a)中所示的m/z 538碎片离子, 其对应于母体离子在250~350及400~450 nm两个波段内的弱吸收, 在550~650 nm波段内对应的强吸收也可以被反映出来。 对于TCPP和TAPP, 也可轻易的看出各个光碎片的贡献以及其紫外-可见光谱的不同[图8(b, c)]。

图8

Fig.8

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	图8 质子化离子2D光解离质谱图 (a): TPP; (b): TCPP; (c): TAPPFig.8 2D photodissociation mass spectra of protonated (a): TPP; (b): TCPP; (c): TAPP

另一方面, AutoDataMS程序还可以非常方便地实现功能的扩展, 以离子相关度分析为例加以说明。 相关度分析可以使研究者得知两个或多个变量之间的变化趋势。 之前的一些工作中曾表明, 质谱的相关度分析可提供质谱定量分析、 离子化以及解离机理等方面信息^[17]。 以图9所示的结果为例, 列出了TPP(m/z 615)在500~650 nm波段内光解离后的一些主要碎片离子以及母离子的相关度分析结果。 可以看出, 母离子与光解离碎片离子的相关度为负, 这是由于碎片离子的产生同时会伴随着母离子的消耗。

图9

Fig.9

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	图9 TPP光解离碎片相关度系数表Fig.9 Correlation coefficient diagram of TPP photodissociation fragments