牛肉样品由河北省廊坊市大厂回族自治县某企业提供。 采集6头36月龄的相同饲养方式的本地黄牛, 按照《牛屠宰操作规程》(GB/T19477—2004)进行屠宰。 宰后在0~4 ℃的冷库中吊挂排酸48 h, 然后取左半胴体背最长肌, 剔除多余的脂肪和结缔组织, 而后切成100 g左右的肉块, 装入真空包装袋, 真空包装后放入-28 ℃以下的冷库中, 使肉块的中心温度在48 h内达到-18 ℃以下, 最后冰运至实验室, 贮存于-18 ℃低温冰箱中备用。 肌原纤维蛋白提取前, 肉样在0~4 ℃下解冻12 h。

TENSOR 27傅里叶变换红外光谱仪(德国布鲁克光谱仪器公司); Avanti J-26S XP高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特商贸有限公司); UltraTurraxT25 BASIS高速匀浆机(德国IKA公司); HI99163 HANNA酸度计(意大利Hanna仪器设备公司); BS214D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司); HH-4型可调恒温数显水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取

肌原纤维蛋白提取参考Doerscher等^[4]的方法, 在低温(0~4 ℃)下提取。 蛋白浓度采用双缩脲法进行测定, 提取的蛋白质在4 ℃下保存, 24 h内用完。

1.3.2 样品制备

用0.6 mol·L^-1 NaCl, 0.05 mol·L^-1 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7.0的缓冲溶液, 将肌原纤维蛋白浓度调至10 mg·mL^-1, 取10 mL分装到试管中, 室温下保持2 h, 而后分别置于54 ℃(rare)、 58 ℃(medium-rare)、 63 ℃(medium)、 68 ℃(medium-well)、 72 ℃(well-done)、 100 ℃(over-cooked)的水浴锅中保温15 min, 以未经加热处理的样品作为对照(control), 保温结束后, 立即取出置于0~4 ℃的冰浴中存放过夜, 第2天进行后续试验。

1.3.3 肌原纤维蛋白ATR-FTIR光谱测定

参考Gangidi等^[5]的方法, 并略作修改。 取适量不同熟度的肌原纤维蛋白溶液置于ATR附件上进行扫描, 通过扣除0.6 mol·L^-1 NaCl, 0.05 mol·L^-1 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7.0的缓冲溶液背景进行基线校准, 扫描范围4 000~400 cm^-1, 信号扫描累加64次, 扫描分辨率为4 cm^-1, 采集红外光谱图。 每种处理图谱扫描重复三次。

1.3.4 数据处理与分析

采用Origin 8.5软件对不同熟度肌原纤维蛋白的红外光谱进行原始、 二阶导数光谱数据处理; 采用2D Shige软件进行二维相关光谱分析, 并利用Origin 8.5软件绘制二维相关光谱图。

在室温(25 ℃)下, 牛肉背最长肌肌原纤维蛋白的红外光谱如图1所示, 肌原纤维蛋白的红外光谱具有一些典型的特征峰, 其谱峰归属如下: 3 500~3 250 cm^-1左右的吸收峰归属为O—H伸缩振动、 N—H伸缩振动以及结合水中的O—H基团与氨基酸中的C=O所形成的分子内和分子间氢键; 1 639 cm^-1处归属为酰胺Ⅰ带C=O对称伸缩振动特征峰, 与氢键作用力密切相关; 1 550 cm^-1处归属为酰胺Ⅱ 带N—H弯曲振动与C—H伸缩振动特征吸收峰; 1 078 cm^-1左右的吸收峰主要是C—O键、 C—N—C键的伸缩振动峰。

图1

Fig.1

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	图1 肌原纤维蛋白红外光谱图Fig.1 ATR-FTIR spectra of beef myofibrillar proteins recorded at room temperature (25 ℃)

在红外光谱中, 酰胺Ⅰ带(1 700~1 600 cm^-1)被广泛用于蛋白质的二级结构分析^{[6, 7]}。 近年来, 随着科学技术的发展和进步, 酰胺Ⅲ带(1 330~1 200 cm^-1)也被用于蛋白质结构区域分析^[8], 并探讨其内部氢键结合情况; 但本研究发现, 酰胺Ⅲ带在红外光谱中吸光强度较弱, 没有出现特征峰, 故在下面选用1 700~1 500 cm^-1波段, 开展肌原纤维蛋白红外谱、 二阶导数谱以及二维相关光谱分析研究。

图2可见, 烹饪熟度对肌原纤维蛋白特征吸收峰强度影响显著(p< 0.05)。 从特征峰强度变化趋势可见, 肌原纤维蛋白特征峰强度变化分为三个阶段: 第一阶段, 从对照组到一分熟, 属于加热初期, 特征峰强度下降; 第二阶段, 从一分熟到五分熟, 属于加热中期, 峰强度无显著变化; 第三阶段, 从五分熟到过熟, 属于加热后期, 峰强度继续减弱。 这与肌肉蛋白组成及其变性温度有关, 肌原纤维蛋白是肌肉中一类重要的结构蛋白质群, 主要由肌球蛋白和肌动蛋白组成, 二者的变性温度分别为: 50~60 ℃和70~80 ℃^[9]。 在加热过程中, 从对照组到一分熟, 此时蛋白的终点温度约为54 ℃左右, 肌球蛋白和少量不耐热的蛋白发生变性引起特征峰强度减弱; 当肌原纤维蛋白被加热至五分熟时, 蛋白的终点温度从54 ℃升高至63 ℃左右, 在这个过程中, 仍以肌球蛋白变性为主, 故特征峰强度无显著变化; 继续加热, 随着蛋白熟度的进一步增加, 肌动蛋白发生变性, 肌原纤维蛋白完全变性, 另一方面, 随着熟度的增加, 部分蛋白发生一定的分解, 从而导致蛋白特征峰强度显著减弱。

图2

Fig.2

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	图2 不同熟度肌原纤维蛋白红外光谱图Fig.2 ATR-FTIR spectra of beef myofibrillar proteins with different degrees of doneness

图3可见, 通过对不同熟度肌原纤维蛋白红外光谱进行二阶导数分析, 结果表明, 对照组样品的红外光谱共分辨出13个特征吸收峰, 其中酰胺Ⅰ带有7个, 酰胺Ⅱ 带有6个。 随着蛋白熟度的增加, 1 528 cm^-1处的峰消失, 同时又出现了4个新的吸收峰, 其中, 在一分熟时出现1 666 cm^-1处的峰, 并且在熟制过程中峰位保持稳定; 在三分熟时出现1 599和1 622 cm^-1处的峰, 峰位随熟度的增加呈现先减小后增大的变化趋势; 在过熟时出现1 589 cm^-1处的峰, 此时肌原纤维蛋白红外光谱共有16个特征吸收峰。

图3

Fig.3

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	图3 不同熟度肌原纤维蛋白1 700~1 500 cm-1二阶导数光谱图 a: Control; b: Rare; c: Medium-rare; d: Medium; e: Medium-well; f: Well-done; g: Over-cookedFig.3 Second derivative spectra of myofibrillar proteins with different degrees of doneness in 1 700~1 500 cm-1

图4可见, 在1 700~1 500 cm^-1波数范围内, 不同熟度的肌原纤维蛋白同步二维相关红外光谱主要在1 650, 1 640, 1 556和1 540 cm^-1附近出现自相关峰, 分别归属于α -螺旋、 无规则卷曲和酰胺Ⅱ 带^[10], 表明这些峰所对应的基团对于熟度的变化较为敏感, 另一方面, 自相关峰两两之间的交叉峰均为正交叉峰, 说明自相关峰光谱强度与蛋白熟度之间呈正相关。 从自相关峰光谱强度顺序可以看出, 五分熟是蛋白温度敏感区变化的转折点, 当蛋白熟度低于五分熟时, 1 540 cm^-1附近的相关峰强度最大; 而当蛋白熟度高于五分熟时, 1 650 cm^-1附近的相关峰强度达到最大, 上述结果表明, 在中低熟度(一分熟至五分熟)下, 蛋白酰胺Ⅱ 带对熟度变化更敏感, 而在中高熟度(五分熟至全熟)下, 蛋白酰胺Ⅰ带的α -螺旋结构对熟度变化更敏感, 综上所述, 随着熟度的增加, 肌原纤维蛋白温度敏感重点区域由酰胺Ⅱ 带转移至酰胺Ⅰ带的α -螺旋结构。

图4

Fig.4

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	图4 不同熟度肌原纤维蛋白同步二维相关红外光谱图Fig.4 Synchronous spectra of beef myofibrillar proteins with different degrees of doneness in the range of 1 700~1 500 cm-1

造成上述现象的原因可能是由于酰胺Ⅰ和Ⅱ 带化学键的振动模式及其力常数的不同所致。 酰胺Ⅰ带主要以C=O键对称伸缩振动为主, C=O键的力常数为12 N·cm^-1; 而酰胺Ⅱ 带的振动模式为N—H键弯曲振动与C—H键伸缩振动, 其中, N—H键、 C—H键的力常数分别为6.4和4.8 N·cm^-1, 均小于C=O键的力常数, 二者的化学键强度均小于C=O键的强度, 所以, 在中低熟度牛排的烹饪过程中, 酰胺Ⅱ 带对熟度的敏感性更高, 而在中高熟度牛排的烹饪过程中, 酰胺Ⅰ带对熟度的敏感性更高。