铝离子对辅酶NADH分子荧光增强和构象变化的影响
张梦婕, 曹思敏, 王梦雨, 李昊阳, 李栋, 赵泽楠, 徐建华*
华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室, 上海 200241
*通讯作者:e-mail: jhxu@phy.ecnu.edu.cn .

作者简介:张梦婕, 女, 1994年生, 华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室硕士研究生e-mail: 504426031@qq.com

摘要

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是生物体内重要的辅酶分子, 在细胞能量代谢中发挥着关键作用。 金属离子可以影响NADH所参与的酶促反应, 其中铝离子(Al3+)对神经系统具有毒性, 可以引发神经退行性疾病。 因此, Al3+和NADH分子间相互作用的研究有助于了解Al3+对生物体内TCA循环和酶促反应的影响, 具有重要的生物学意义。 本文采用紫外-可见吸收和稳态荧光光谱, 结合时间相关单光子计数技术(TCSPC), 研究了Al3+对水溶液中NADH的本征荧光光谱和分子构象变化的影响。 紫外-可见吸收光谱显示, NADH与Al3+的结合不会改变NADH分子腺嘌呤和烟酰胺两个本征发色团的吸收特性。 为避免NADH分子内两个本征发色团之间的荧光共振能量转移效应的影响, 采用340 nm作为激发波长, 比较了NADH与Al3+作用前后的荧光特性。 实验结果证实, Al3+可以与NADH焦磷酸盐桥上的两个氧原子相结合, 使NADH分子的结构变得相对更加刚性, 从而抑制NADH分子在溶液中的转动等非辐射过程, 导致NADH分子平均荧光寿命增加, 最终引起NADH分子荧光强度随Al3+浓度的增加而线性增强。 进一步, 采用NADH本征荧光寿命振幅比的研究方法表征了NADH分子在溶液中的两种主要构象形式: 腺嘌呤和烟酰胺相互堆积的折叠构象以及腺嘌呤和烟酰胺相互分离的展开构象。 研究发现, Al3+会打破溶液中NADH分子展开构象和折叠构象的平衡状态, 促使辅酶NADH分子的展开构象转变为折叠构象, 最终达到新的动态平衡, 并且当NADH和Al3+以不大于1∶2的浓度比结合时, NADH分子两种构象的振幅比与铝离子浓度的对数间存在线性关系, 在Al3+浓度检测等领域具有良好的应用前景。

关键词: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸; 铝离子; 荧光光谱技术; 时间相关单光子计数技术; 折叠构象; 展开构象
中图分类号:O433.4 文献标志码:A
Fluorescence Enhancement and Conformational Studies of Coenzyme NADH With Aluminum
ZHANG Meng-jie, CAO Si-min, WANG Meng-yu, LI Hao-yang, LI Dong, ZHAO Ze-nan, XU Jian-hua*
State Key Laboratory of Precision Spectroscopy, East China Normal University, Shanghai 200241, China
*Corresponding author
Abstract

Nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form) (NADH), as an important coenzyme molecule in enzymes, is ubiquitously involved in the organism and plays a key role in cellular energy metabolism. Metal ions can affect the NADH participating enzymes reactions. Aluminum ions (Al3+) are toxic to the nervous system and can cause a range of neurodegenerative diseases. Therefore, the study on the interaction between NADH and Al3+ is significantly helpful to understand the influence of Al3+ on the TCA cycle and enzymatic reaction in vivo. In this paper, the effects of Al3+on the intrinsic fluorescence characteristics and molecular conformations of NADH in aqueous solutions have been investigated using UV-visible absorbance and steady-state fluorescence spectroscopy combined with time-correlated single photon counting technique (TCSPC). UV-visible absorption spectrum shows that NADH’s combination with Al3+ does not change the absorption characteristics of NADH’s adenine and reduced nicotinamide chromophores. We chose 340 nm as the excitation wavelength to avoid the fluorescence resonance energy transfer (FRET) between the NADH’s two intrinsic chromophores. It was proved that Al3+ could be coordinated to the two oxygen atoms on the hydroxyl group of NADH pyrophosphate bridge, which would make the NADH structure relatively more rigid, there by inhibiting the non-radiative processes such as the molecular rotation of NADH molecule in solution, resulting in the increase in the average fluorescence lifetime of the NADH molecule. Therefore, a fluorescence enhancement of the NADH molecule was observed by increasing Al3+ concentrations. Furthermore, we used the intrinsic fluorescence lifetimes amplitude ratio of NADH to characterize the two main conformational forms of the NADH in solution: folded form in which the adenine and nicotinamide groups are stacked parallel to each other, and unfolded form where the two bases apart from each other. It was found that Al3+ would break the original equilibrium of two conformations of NADH, making coenzyme NADH have a clear preference from the unfolded towards folded conformation, and eventually a new dynamic equilibrium would be achieved. Interestingly, it was revealed that the amplitude ratio increased logarithmically with the concentration of Al3+ when the concentration ratio of Al3+∶NADH was not more than 1∶2, showing a potential application prospect in Al3+ detection.

Keyword: NADH; Aluminum ions; Fluorescence spectroscopy; Time correlated single photon counting technique (TCSPC); Folded conformation; Unfolded conformation
引言

铝是地球上含量最丰富的金属元素, 因其具有良好的导热性、 延展性等诸多优良性能, 在现代社会生产活动中用途极为广泛, 例如药品和化妆品制造、 包装袋和食品添加剂生产, 以及生活饮用水净化都离不开铝[1, 2]。 在给人类带了便利的同时, 铝离子及其化合物对人体也存在一定程度的危害。 研究发现, Al3+被人体吸收以后会在体内慢慢积累, 然后进入人的大脑, 干扰神经元线粒体的生理功能, 抑制大脑中的代谢酶, 从而使得大脑产生代谢错误, 最终导致中枢神经系统紊乱损害脑细胞[3]。 Al3+过量积累而引起的中枢神经紊乱, 在临床上会引起阿尔茨海默氏症和帕金森病等神经退行性疾病[4], 这种发生在生物体内的病理性衰老是一种不可逆的变化。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide)及其还原态NADH是普遍存在于真核生物和原核生物中的重要辅酶, 参与生物氧化还原过程, 并在细胞物质及能量代谢过程中发挥关键作用。 在生物体内, NADH产生于糖酵解过程和细胞呼吸作用中的柠檬酸循环(TCA cycle), 作为线粒体中氧化磷酸化电子传递链的主要电子供体参与细胞内ATP的合成。 因此, NADH的氧化还原状态是表征细胞活力的最佳参数, 在细胞代谢过程中发挥抗衰老作用。 临床实验表明, NADH能够显著促进神经递质多巴胺的产生, 有助于帕金森病症状的改善。 同时, OADH能促进去甲肾上腺素和血清素的生物合成, 对于缓解抑郁症和阿尔茨海默氏症具有良好的应用潜力[5]。 因此, 研究Al3+与NADH的相互作用, 从而了解Al3+在TCA循环和酶反应体系中的作用和机理, 对于生物衰老过程的研究具有非常重要的价值。

NADH由二氢烟酰胺、 腺嘌呤和两个核糖环通过焦磷酸盐桥的连接所组成。 目前, 通过荧光光谱, 圆偏振, 拉曼光谱, 多核(1H, 13C, 31P)-核磁共振光谱和X射线晶体学等研究方法对NADH的结构及构象进行了分析[6, 7, 8]。 如图1所示, NADH通常会以两种构象的形式存在— — 展开态和折叠态, 并且两种构象之间存在动态平衡。 在溶液中游离的NADH具有折叠构象, 而与蛋白质相结合的NADH则会以展开构象存在。 细胞中展开构象的NADH含量越高就代表细胞的活性越高, 反之, 细胞中折叠构象的NADH含量越高就代表细胞的活性越低, 甚至完全失活直至衰亡。 因此游离的NADH和与蛋白结合的NADH的比率作为细胞代谢状态的良好指标, 常常被用来研究细胞中NADH含量的检测以及细胞的物质及能量代谢过程。 由于Al3+对生物磷酸盐具有良好的亲和力, 因此在水溶液中, Al3+会以双配位单齿形式优先配位NADH焦磷酸盐桥羟基上的两个氧原子, 产生两个强离子Al…O键。 此外, 溶液中的NADH与Al3+周围第一个溶剂化层的高度极化水之间还存在氢键相互作用, 使得NADH与Al3+结合后形成了更加刚性稳定的结构[9]

图1 水溶液中NADH折叠构象和展开构象之间的平衡图Fig.1 Equilibrium diagram of NADH folded and unfolded conformations in aqueous solution

虽然一些金属离子在NADH参与的酶反应中具有非常重要的作用[10], 然而关于金属离子引起NADH构象变化的研究工作却很少, 仅有关于Mn2+, Li+, La3+和Eu3+对于NAD+/NADH构象影响的少数报道[8]。 本文采用荧光光谱技术和TCSPC技术, 以NADH本征荧光寿命振幅比的方法系统研究了水溶液中Al3+浓度在NADH构象变化中的作用。

NADH具有腺嘌呤和烟酰胺两个发色团, 两个发色团分别在260和340 nm处有吸收峰, NADH荧光特性的研究有助于细胞内线粒体功能的表征。 迄今为止, 大部分NADH的构象研究都依赖于采用260 nm直接激发腺嘌呤发色团[6, 11], 这会使得NADH分子内发生从腺嘌呤到烟酰胺的能量转移[11], 从而使得NADH荧光增强。 此外, 能量转移效率虽大部分取决于NADH的折叠状态, 但即使NADH在完全展开的状态下能量转移效率也不可忽略[12], 因此直接激发腺嘌呤会对NADH和其他物质相互作用后NADH荧光特性的研究具有一定的影响。 相比于腺嘌呤发色团, 激发烟酰胺发色团则可以避免能量转移对NADH荧光特性产生的附加影响, 从而更好地研究NADH和其他物质相互作用的荧光特性。 因此, 本文选用340 nm作为激发波长直接激发烟酰胺发色团, 研究和比较没有Al3+和存在不同浓度的Al3+时NADH分子的稳态荧光和时间分辨荧光特性。

1 实验部分
1.1 仪器及设置

稳态吸收光谱用紫外-可见分光光度计(TU1901, 北京普析通用仪器有限公司)测量。 测量时将探测波长范围设置为190~500 nm。 稳态荧光光谱用FluoroMax-4型荧光光谱仪(Horiba, 美国)测量。 测量时将光谱带宽参数设置为2 nm× 2 nm, 激发波长设置为340 nm, 以激发二氢烟酰胺环。

待测样品的时间分辨荧光数据是采用TCSPC技术测量所得。 在TCSPC系统中, 使用半导体激光器(PDL800-B, PicoQuant, 德国)产生以340 nm为中心波长, 重复频率为10 MHz的激发光脉冲。 使用单光子计数光电倍增管(PMA165A-N-M, PicoQuant, 德国)和时间相关单光子计数(TCSPC)模块(PicoHarp300, PicoQuant, 德国)收集并记录荧光。 该系统具体细节见文献[13]报道。 通过自主编写的数据采集软件, 对采集到的荧光衰减数据进行分析, 数据拟合到多指数衰减模型中得到待测样品的寿命分量以及与寿命相对应的振幅分量。 数据拟合效果采用 XR2函数进行评估。

1.2 样品制备

β -NADH二钠盐购自阿拉丁(上海, 中国); 三氯化铝试剂(Aluminum chloride ReagentPlus(R), 简写为AlCl3), 237051-100G, 光谱级, ≥ 99%, Sigma-Aldrich; Tris-base、 NaCl以及硫酸奎宁(Quinine sulfate, 简写为QS)均购自Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇中国); 浓硫酸(H2SO4), 10021608, GR(沪试), 95.0%~98.0%, 购自国药集团化学试剂有限公司。 本研究所使用的生物分子样品以及化学试剂, 均来源于商业购买且在实验过程中未经过任何加工及提纯处理。

为获取最大信噪比, 得到最佳的实验效果, 在排除NADH荧光内滤效应的影响后, 选择300 μ mol· L-1作为实验中NADH测试溶液的浓度, 具体操作为: 以Tris-HCl缓冲液(50 mmol· L-1 Tris-base, 150 mmol· L-1 NaCl, pH 7.35)作为溶剂, 配制600 μ mol· L-1的NADH储备液以及不同浓度梯度的AlCl3储备液(100, 150, 300, 600和1 200 μ mol· L-1)。 准确量取一定量(700 μ L)的600 μ mol· L-1 NADH储备液于5个不同的离心管中, 依次向离心管中滴加等量不同浓度梯度的AlCl3储备液并混合均匀。 最终混合液中NADH的浓度为300 μ mol· L-1, 相对应的Al3+浓度依次为50, 75, 150, 300和600 μ mol· L-1。 同时制备一组300 μ mol· L-1的NADH溶液作为空白对照组。

以浓度为0.5 mol· L-1的H2SO4作为溶剂, 在玻璃瓶中(避光条件下)配制5组不同浓度梯度的QS溶液, 并使得5组QS溶液在340 nm处的吸光度值均小于0.1。 以Tris-HCl缓冲液作为溶剂, 在离心管中配制5组不同浓度梯度的NADH溶液, 以及5组NADH和Al3+浓度的摩尔比为1∶ 2的不同浓度梯度的混合液, 并使得各组NADH溶液以及混合液在340 nm处的吸光度分别与5组QS溶液的吸光度相同。

实验中, 我们将所有待测样品均置于相同规格的石英比色皿中进行测量。 所有实验均在室温下进行测量且重复三次。 每次实验均配制新鲜的样品溶液, 并且在每次时间分辨荧光测量前后仔细检查样品吸收光谱, 以确保样品没有损坏。

2 结果与讨论
2.1 紫外-可见吸收光谱

图2是随着Al3+浓度的增加, NADH(300 μ mol· L-1)在Tris-HCl缓冲液中的吸收光谱。 实验结果表明, 在水溶液中NADH存在两个吸收峰(260和340 nm), 分别对应于腺嘌呤和烟酰胺两个发色团的特征吸收。 随着Al3+浓度的增加, NADH在260和340 nm处的吸光度均未发生变化, 并且其吸收光谱的形状也未随Al3+的加入而改变。 因此, Al3+和NADH的结合不会直接引起这两个本征发色团吸收特性(能级结构、 带宽等)的明显改变。

图2 Al3+浓度(0~600 μ mol· L-1)增加时NADH(300 μ mol· L-1)的紫外-可见吸收光谱图Fig.2 UV-Visible absorbance spectra of NADH (300 μ mol· L-1) with increasing Al3+ concentration (0~600 μ mol· L-1)

2.2 稳态荧光光谱

采用340 nm作为激发波长, 在470 nm处监测NADH的荧光发射, 给出了不存在Al3+和存在不同浓度Al3+时, NADH(300 μ mol· L-1)荧光强度变化的实验数据图3(a)。 荧光发射光谱显示, NADH的荧光强度随着Al3+浓度的增加而增加。 图3(b)为NADH(300 μ mol· L-1)在470 nm发射波长处, 稳态荧光强度随Al3+浓度增加的线性拟合图。 从图中可以看出, NADH的荧光强度与Al3+的浓度呈正相关, 线性相关系数为r=0.998 92。

图3 Al3+浓度(0~600 μ mol· L-1)增加时NADH(300 μ mol· L-1)的稳态荧光光谱图Fig.3 Steady state fluorescence spectra of NADH (300 μ mol· L-1)with increasing Al3+ concentration (0~600 μ mol· L-1)

Yang等的研究表明[8], Al3+和NADH结合会促使NADH向折叠态发展, 使得NADH中腺嘌呤环和烟酰胺环之间距离减小, 当激发波长为260 nm时, 发生从腺嘌呤到烟酰胺的荧光共振能量转移(FRET), 从而导致NADH荧光强度增加。 但如图3所示, 我们以340 nm作为激发波长时, 也观察到了类似的荧光增强现象。 为进一步研究Al3+存在下NADH荧光增强的机理, 我们进行了荧光量子产率(quantum yield, QY)和荧光寿命的测量。 利用辐射跃迁速率(Γ )和非辐射跃迁速率(knr)可以将荧光量子产率表示为[14]

QY=ΓΓ+knr(1)

在这项工作中, 我们以硫酸奎宁染料(QS)作为参比[15], 通过比较加入Al3+前后NADH与QS的积分荧光强度值(在340 nm处激发)和吸收值(在340 nm处), 计算得到了加入Al3+前后NADH的QY, 见图4(测量误差为± 0.001)。 通过式(2)和式(3)可以计算得到加入Al3+前后NADH的QY分别为QYNADH=0.018, QY(NADH∶ Al=1∶ 2)=0.021

图4 加入Al3+前后NADH量子产率(QY)的拟合计算图, 以硫酸奎宁染料(QS)为对照Fig.4 Fitting calculation chart of NADH quantum yield (QY) before and after adding Al3+, using quinine sulfate (QS) as a reference

$QY_{NADH}=QY_{QS}\frac{m_{NADH}}{m_{QS}} \frac{\eta_{2}^{2}}{\eta_{1}^{2}}$(2)

$QY_{NADH:Al=1:2}=QY_{Q} \frac{m_{NADH:Al=1:2}}{m_{QS}} \ \ \frac{\eta_{2}^{2}}{\eta_{1}^{2}}$(3)

其中, QYQS是QS的量子产率, 大小为0.55[16]; η 1, η 2, η 3均是水的折射率, 大小为1.33; mNADH, m(NADH∶ Al=1∶ 2), mQS分别是加入Al3+前NADH、 加入Al3+后NADH、 QS的积分荧光强度与吸光度曲线的斜率。

通过对TCSPC实验数据进行双指数拟合发现, Al3+的加入会使得NADH的平均寿命发生变化, 详细描述见下文。 根据激发态寿命理论, 物质的荧光寿命(τ )主要取决于辐射跃迁寿命和非辐射跃迁寿命, 定义为衰减总速率的倒数。 因此用Γ knr可以将荧光寿命表示为[14]

τ=1Γ+knr(4)

结合式(1)— 式(4), 代入Al3+浓度为0和600 μ mol· L-1时, 在荧光峰值(470 nm)处测量所得的NADH的平均寿命(分别为0.26和0.32 ns, 见表2)进行计算, 得到了加入Al3+前NADH的辐射跃迁速率和非辐射跃迁速率分别为: Γ 1=0.069× 109 s-1, knr1=3.777× 109 s-1。 加入Al3+后NADH的辐射跃迁速率略有下降(Γ 2=0.066× 109 s-1), 而非辐射跃迁速率则降低明显, knr2=3.059× 109 s-1, 见表1。 这是由于在水溶液中, Al3+可以和NADH焦磷酸盐桥羟基上的两个氧原子进行结合, 使得NADH分子展开构象转变为更加稳定的折叠构象, 变成相对更加刚性的结构[9]。 在这种转变过程中, Al3+固定水溶液中的NADH, 抑制其转动等非辐射过程, 使得激发态NADH分子相对更多地通过辐射通道弛豫回基态, 从而导致NADH分子荧光增强。

表1 加入Al3+前后NADH的辐射跃迁速率和 非辐射跃迁速率 Table 1 The radiation and non-radiation decay rates of NADH before and after adding Al3+
表2 不同波长下NADH荧光寿命及振幅随Al3+浓度变化的TCSPC拟合参数 Table 2 Fitting parameters of NADH fluorescence lifetimes and amplitudes at different wavelength as a function of Al3+ concentration

采用260 nm激发NADH时, 研究普遍认为Al3+会促使NADH向折叠构象转变, 其荧光增强主要是由于折叠构象的NADH发生分子内能量转移现象而引起的。 我们采用340 nm激发烟酰胺环, 有效地避免了能量转移现象的发生, 然而NADH荧光依然存在明显增强。 以上结果表明, 不同于260 nm激发腺嘌呤, 340 nm激发烟酰胺避免了NADH两个发色团之间能量转移对NADH和Al3+结合后NADH荧光特性产生的影响, 而通过Al3+抑制NADH在水溶液中的非辐射过程使得其荧光增强。 进而, Al3+和NADH相互作用后, NADH本征荧光增强不仅是由于NADH两个发色团之间发生了荧光共振能量转移, 还由于NADH的转动等非辐射过程被抑制。 因此, 在水溶液中加入Al3+并用260 nm激发时, NADH腺嘌呤环和烟酰胺环之间发生能量转移并非是NADH荧光增强的唯一因素, Al3+对NADH非辐射过程的抑制作用也不容忽视。

2.3 时间分辨荧光光谱

通过TCSPC技术, 我们进一步研究了水溶液中Al3+在NADH构象变化中的作用。 我们选取三个不同波长(蓝端450 nm、 NADH荧光峰值470 nm、 红端490 nm)进行测量, 在不存在Al3+和存在不同浓度Al3+(50~1 200 μ mol· L-1)时, 测量了NADH(300 μ mol· L-1)的荧光衰减数据。

大量研究证实, 在水溶液中, NADH存在244和690 ps两个寿命[17], NADH的荧光衰减曲线可以通过双指数衰减模型(5)来描述

I=α1exp-tτ1+α2exp-tτ2(5)

我们对不同波长下不存在Al3+和存在不同浓度Al3+时NADH的荧光衰减曲线进行双指数拟合, 得到最佳的α , τ τ̅等参数, 详见表2。 其中τ 1τ 2分别是NADH的短寿命和长寿命, α 1α 2分别是NADH短寿命和长寿命相对应的振幅, τ̅是NADH的平均寿命。

表2实验结果表明, 随着Al3+浓度升高(0~1 200 μ mol· L-1), NADH折叠构象所对应的短寿命和展开构象所对应的长寿命各自所占的组分发生了变化。 在0~600 μ mol· L-1的范围内, 随着Al3+浓度增加, 短寿命所占组分逐渐增加, 长寿命所占组分逐渐减小。 当Al3+浓度增加到600 μ mol· L-1以上时, NADH两种寿命所占的组分将趋于稳定。 这是由于在水溶液中Al3+和NADH的相互作用, 使得展开态的NADH会转变为折叠态的NADH, 这种转变是NADH两种构象之间发生的单向的转变。 同时, NADH的短寿命和长寿命均随Al3+浓度的升高而逐渐增加。 虽然Al3+和NADH的结合会引起NADH短寿命成分相对占比增加, 但NADH的两个本征寿命也在逐渐增加, 因此NADH的平均寿命随Al3+浓度的升高也在逐渐增加, 从而导致NADH分子荧光增加。 这与之前稳态荧光实验的结果相一致。

随后, 我们采用NADH本征荧光寿命振幅比的形式, 进一步研究Al3+浓度对NADH构象变化的影响。 不同波长下NADH短寿命振幅和长寿命振幅比随Al3+浓度的变化如图5(a)所示。 结果显示, 三个波长下的荧光寿命振幅比均随着Al3+浓度的升高而增加, 而振幅比增速逐渐减小, 直到Al3+浓度达到600 μ mol· L-1时振幅比基本趋于饱和稳定。 在图5(a)的基础上, 我们对Al3+浓度坐标采用对数坐标, 发现对数坐标中三个波长下NADH本征寿命振幅比与Al3+的浓度之间存在良好的线性关系, 如图5(b)所示, 线性相关系数R2均大于0.99。 因此, 我们首次实验证实NADH荧光寿命振幅比随Al3+浓度增加以对数增长, 即: α 12∝ ln cAl3+。 该发现可以应用于NADH本征荧光寿命检测体内铝离子浓度, 对慢性神经退行性疾病的诊断和预防以及环境的监测和保护具有潜在应用价值。

图5 不同波长下NADH短寿命和长寿命的振幅比随Al3+浓度变化图, (b)横坐标为ln对数坐标Fig.5 The ratios of short-life to long-life amplitude of NADH at different wavelength versus Al3+ concentration. The horizontal axis in (b) is logarithmic

综上所述, 时间分辨荧光光谱实验结果表明当NADH和Al3+在以不大于1∶ 2的浓度比率进行结合时, 会促使NADH分子向折叠态转变, 最终水溶液中NADH的这两种分子构象将会重新达到动态平衡。 到目前为止, 我们最先报道了以NADH分子作为荧光基团, 采用NADH本征寿命振幅比的方法研究Al3+对于水溶液中NADH分子构象变化的影响。

3 结论

发现Al3+和NADH在水溶液中的结合没有改变NADH的荧光基团能级结构, 但对NADH的本征荧光寿命以及分子构象变化具有较大影响。 Al3+的存在会使得NADH分子结构变得相对更加刚性, 抑制其在水溶液中的分子转动等非辐射过程, 从而引起NADH平均寿命的增加, 最终导致NADH分子荧光增强。 此外, 通过本征荧光寿命振幅比研究方法发现, Al3+会打破水溶液中NADH展开态和折叠态的平衡状态并促使其向折叠态转变, 在0~600 μ mol· L-1的范围内, 振幅比α 12随着ln εAl3+增加而线性增加, 可被进一步应用于生物体Al3+浓度检测。 Al3+对NADH构象影响的研究结果, 也能够帮助进一步理解Al3+在生物酶催化反应中的作用, 具有重要的生物学价值。

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