堆肥试验场地依托安徽莱姆佳生物科技股份有限公司, 采用槽式发酵工艺对5t小麦秸秆进行为期98 d的好氧堆肥试验。 具体堆肥过程见文献[10]。 根据发酵温度, 每隔4~7 d机械翻堆1次。 分别在1, 7, 14, 24, 38, 56, 72及98 d翻堆当天进行采样, 每次分别在10, 20和30 cm深度随机取4个点位进行堆肥样品采集。 实验室内对堆肥样品进行充分混合, 冷冻干燥, 研磨并过筛, 最终制备得粒径< 1 mm堆肥样品待测试。

将待测试堆肥样品按照1 g∶ 10 mL的比例加入超纯水, 在恒温振荡器中25 ℃, 200 r· min^-1条件下往复振荡提取24 h。 悬浊液于10 000 r· min离心20 min, 上清液过0.45 μ m水系滤膜, 所得滤液中的有机物即DOM。 每个样品重复3次。 将上述DOM溶液稀释80倍, 用于含量和光谱测试。

采用岛津TOC-VCPN分析仪, 对堆肥DOM中DOC含量进行测试。 采用岛津UV-2600光谱仪对堆肥DOM的UV-Vis光谱进行测定, 扫描波长范围为200~700 nm, 扫描间隔为1 nm。 采用日立Hitachi F-4600荧光光谱仪对DOM的三维荧光光谱(EEM)进行测定。 激发(Ex)和发射(Em)波长范围分别设置为200~400和280~520 nm, 扫描间隔均为5 nm, 扫描速度设置为2 400 nm· min^-1。

本研究分别从UV-Vis吸收光谱和EEM光谱中提取参数SUVA₂₅₄和HIX。 计算方法^{[1, 2]}如下: SUVA₂₅₄是波长254 nm处的特征吸收参数(SUVA254=100× A₂₅₄/DOC)。 腐殖化指数(HIX)为Ex=254 nm时, Em在435~480 nm区域与300~345 nm区域积分面积的比值。

采用Matlab 2014a中的DOMFluor工具箱对上述24个堆肥DOM的EEM进行PARAFAC分析。 利用残差分析与半分法确定最优荧光组分数, 利用折半分析检验PARAFAC模型的有效性, 最终确定堆肥DOM荧光物质组分及其强度(Fmax)^{[6, 8, 9]}。

使用Excel 2016对试验数据进行统计分析, 使用SPSS 18.0进行相关性分析, 使用OriginPro2018和CorelDRAW X6进行图形的绘制。

图1可看出, 小麦秸秆堆肥DOC的变化基本呈现4个阶段。 堆肥1~14 d, DOC含量迅速从8.7 mg· g^-1下降至7.1 mg· g^-1, 下降幅度达18%; 结果说明堆肥初期, 微生物降解作用显著。 堆肥14~24 d, 堆肥DOC含量有较大的提升, 这可能与秸秆部分易分解的组分开始水解或生物降解产生新的DOC, 甚至是微生物自身快速增长释放DOC有关。 堆肥24~56 d, DOC含量基本无变化(~7.9 mg· g^-1), 说明秸秆组成(如木质素、 纤维素等)水解和DOM微生物降解处于动态平衡状态。 堆肥56~98 d, DOC含量呈现显著的下降趋势。 考虑到后期堆肥pH值呈中性(pH 7, 图1)不利于微生物生长^[6], DOC的下降可能归因于DOM的化学分解或分子聚合生成不溶于水的大分子腐殖质^[4]。 堆肥完成后DOC降解了约23%, 明显低于畜禽粪便及与作物秸秆共肥过程中DOC的降解率(31%~89%)^{[4, 8]}。 结果表明小麦秸秆堆肥过程与畜禽粪便堆肥过程存在差异。

图1

Fig.1

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	图1 溶解性有机碳(DOC)和堆肥pH值变化Fig.1 Changes of DOC contents and compost pH values

2.2.1 UV-Vis光谱

图2显示小麦秸秆堆肥过程中DOM的UV-Vis光谱均呈现随波长增加吸收强度下降的特征, 类似于猪粪^[11]和鸡粪^[12]等堆肥DOM的UV-Vis光谱特征。 此外, 1~38 d堆肥DOM的UV-Vis光谱均在280 nm附近出现一个明显的吸收平台, 从56 d开始, 该吸收平台逐渐消失。 研究表明, 280 nm处吸收峰可能来自木质素及其衍生物等特征有机物的吸收, 由此可知小麦秸秆堆肥过程中木质素等组分发生显著分解, 而中间产物通过生物降解或化学聚合作用也不断减少^[4]。 该演化特征与畜禽粪便堆肥DOM的UV-Vis光谱峰型变化特征一致^[12]。 值得注意的是, 整个秸秆堆肥期间DOM的UV-Vis光谱基本呈现下降趋势, 尤其是98 d的DOM光谱强度明显低于1 d, 表明堆肥DOM中芳香族化合物含量显著减少。 这可能与微生物的降解或化学聚合生成不溶水的大分子腐殖质有关。 文献报道的畜禽粪便堆肥过程中DOM的UV-Vis光谱基本呈增加的趋势^[12]。 对比可知秸秆单一物料堆肥与畜禽粪便(包括与秸秆共肥)堆肥过程中DOM的分子结构和组成演变存在差异。

图2

Fig.2

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	图2 堆肥DOM的紫外-可见光吸收光谱变化Fig.2 Changes of normalized UV-Vis spectra in DOM during composting

2.2.2 三维荧光光谱(EEM)

图3显示的是小麦堆肥过程中DOM的EEM光谱变化。 根据文献^{[1, 3, 11]}, 对堆肥DOM的荧光峰(A— E, H)进行识别。 峰A(Ex/Em, 220/410 nm)归属为类富里酸荧光峰, 峰B(Ex/Em, 270/410 nm)和C(Ex/Em, 305/410 nm)均属于类腐殖酸荧光峰, 峰D(Ex/Em, 280/340 nm)和E(Ex/Em, 220/330 nm)均归属为类蛋白荧光峰。 从图3可看出, 堆肥1~56 d, 峰D和E强度逐渐减弱, 表明堆肥过程中类蛋白质物质发生显著的降解。 同时, 峰A, B和C不断增强, 表明类腐殖质逐渐演变为DOM的主要物质组成; 峰A强度的显著增强, 表明堆肥过程类富里酸物质不断生成和累计, 进而成为DOM最主要的部分。 该结果同污泥^[1]、 猪粪^[11]和沼渣^[2]堆肥EEM光谱荧光峰演化结果一致。 值得注意的是, 72和98 d的EEM光谱中峰A和峰B几乎消失, 但呈现出新的强类富里酸荧光峰H(Ex/Em, 245/425 nm)^[11]。 该峰的出现可能与DOM中类腐殖质间发生的聚合或低pH引起的DOM中芳香族结构的质子化作用等有关。

图3

Fig.3

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	图3 小麦秸秆堆肥过程中DOM的EEM谱图随时间的变化Fig.3 Temporal evolution of fluorescence excitation-emission matrix spectra of DOM during wheat straw composting

2.2.3 SUVA₂₅₄, HIX

紫外特征参数SUVA₂₅₄可有效表征堆肥DOM的芳构化程度^{[2, 5]}, SUVA₂₅₄值越大, DOM芳构化越强。 腐殖化指数(HIX)是一种评价堆肥DOM腐殖化程度的重要参数, HIX值越大表明DOM的腐殖化程度越高^[2]。 由图4可以看出, 堆肥过程中DOM的SUVA₂₅₄和HIX呈现相似的变化规律。 堆肥1~14 d, DOM的SUVA₂₅₄和HIX分别从2.5 m²· gC^-1和2.34迅速升高至3.3 m²· gC^-1和4.65, 表明DOM中芳构化和腐殖化程度显著增加。 堆肥14~24 d, SUVA₂₅₄和HIX显著降低, 可能与前期微生物大量繁殖促进具有芳香族结构的腐殖质降解有关。 堆肥24~56 d, DOM的SUVA₂₅₄值略升高, 而HIX显著增大, 可能与微生物不断降解非腐殖质物质, 同时生成腐殖类物质, 致使富含芳香族结构的腐殖质含量显著提升有关。 堆肥56~98 d, SUVA₂₅₄和HIX再次降低, 说明堆肥后期DOM的芳构化和腐殖化程度减弱。 这可能与后期堆肥pH值的不断降低, 引起DOM去官能团化或质子化有关, 尤其表现为72~98 d堆肥pH由7.8降至7.0, 对应DOM的SUVA₂₅₄和HIX显著降低。 小麦秸秆堆肥过程中DOM的SUVA₂₅₄值分布为2.5~3.3 m²· gC^-1, 略高于畜禽粪便^[4]、 沼渣^[2]和城市污泥^[1]的SUVA₂₅₄值(0.16~2.14 m²· gC^-1), 说明小麦秸秆堆肥过程主要涉及高芳香度的有机质演变。 堆肥结束DOM的HIX为5.24, 约为堆肥初期的2.2倍, 表明小麦秸秆堆肥过程DOM腐殖化程度显著提高。

图4

Fig.4

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	图4 堆肥DOM的SUVA254和HIX变化特征Fig.4 Changes of E2/E3 and SUVA254 values of DOM during composting

EEM-PARAFAC可进一步定量研究堆肥过程中DOM的组成演变特征。 如图5所示, PARAFAC共解析出堆肥DOM中3类荧光组分。 根据文献[3, 6-7, 9], 荧光组分C1 [Ex/Em, 230(305)/420 nm]、 C2 [Ex/Em, 260(365)/460 nm]和C3 [Ex/Em, 280(< 220)/350 nm]分别归属为类富里酸、 类腐殖酸和类蛋白物质。 小麦秸秆堆肥DOM的荧光组分与已报道的畜禽粪便和市政污泥堆肥中DOM的荧光物质组成类似^{[6, 7, 9]}。

图5

Fig.5

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	图5 小麦秸秆堆肥DOM中(C1, C2, C3)3类荧光组分Fig.5 Three fluorescence components (C1, C2, C3) of wheat straw compost DOM

图6显示堆肥DOM荧光组分的相对含量演变特征。 由图6可看出, 类蛋白物质(C3)是堆肥前期DOM中最主要的荧光组分, 相对含量占42%。 随着堆肥的进行, C3所占的比重呈降低趋势, 堆肥98 d后DOM的类蛋白物质相对含量降至20%。 结果表明, 小麦秸秆堆肥期间, DOM中类蛋白物质发生显著的微生物降解, 可能是由于类蛋白物质结构简单和微生物可利用性强造成的。 与此同时, 类富里酸(C1)的相对含量逐渐增加, 从堆肥前的41%上升到堆肥后的53%, 成为堆肥中最主要的荧光物质。 小麦秸秆中不溶组分不断水解以及微生物降解中间产物间复杂的化学聚合作用^{[6, 7]}, 进而生成大量的具有稳定度高、 聚合程度强的类富里酸物质, 可能是引起C1相对含量不断增加的主要原因。 类腐殖酸物质(C2)的相对含量在堆肥过程中亦呈现显著的增强趋势。 堆肥前C2的比重只占17%, 堆肥结束后其相对含量达27%, 甚至高于类蛋白物质。 这些结果与前期报道的各种堆肥过程中DOM的荧光物质组成演化特征一致^{[7, 9]}。 大量研究证实堆肥过程实际是一种腐质化过程, 且堆肥以腐殖质组成为主^{[6, 9]}。 堆肥过程中, DOM中类腐殖质物质(C1和C2)与类蛋白物质相对含量比例的变化特征见图5。 堆肥期间C1/C3和C2/C3具有相同的演变特征, 均表现为随着堆肥的进行比例不断增大的趋势。 堆肥前后, C1/C3和C2/C3分别由0.97和0.40升高至2.60和1.32, 进一步证实堆肥过程中DOM腐殖化程度的增强。

图6

Fig.6

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	图6 堆肥DOM的荧光物质组成演变Fig.6 Changes of fluorescence components within DOM during composting

为探究堆肥过程中DOM组成和结构演变之间的关系, 对堆肥DOM的SUVA₂₅₄、 HIX、 荧光组分(C1— C3)含量和DOC进行了相关性分析, 结果如表1所示。 类富里酸(C1)和类腐殖酸(C2)均与HIX呈极显著正相关(r=0.806~0.853, p< 0.01), 类蛋白物质(C3)与HIX呈显著负相关(r=-0.876, p< 0.05)。 说明堆肥DOM的腐殖化程度与类腐殖质和类蛋白相对组成有直接关系。 值得注意的是, 荧光物质组成(C1— C3)和HIX值均与SUVA₂₅₄呈弱相关, 表明DOM的芳构化与其腐殖化程度关系并不明显。 这可能是由微生物降解、 化学聚合以及堆肥酸碱度等复杂因素造成的。 此外, DOC与类腐殖质荧光组分(C1和C2)之间的相关性也较弱(r=-0.120~-0.131), 说明类腐殖质的降解和生成与DOC的演变关系不明显; 同时DOC与类蛋白物质(C3)具有显著正相关性(r=0.415, p< 0.05), 表明类蛋白物质的降解是引起DOC降低的一个重要因素。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 堆肥DOM的荧光组成与光谱特征参数的相关性 Table 1 Correlation analysis between fluorescence components and spectra parameters C1 C2 C3 SUVA254 HIX C2 0.925* * C3 -0.510* -0.709* * SUVA254 0.120 0.074 -0.254 HIX 0.806* * 0.853* * -0.876* * 0.327 DOC -0.120 -0.131 0.415* -0.166 -0.263 注: * 在0.05水平(双侧)上显著相关; * * 在0.01水平(双侧)上显著相关

表1 堆肥DOM的荧光组成与光谱特征参数的相关性 Table 1 Correlation analysis between fluorescence components and spectra parameters