基于Raman和FTIR揭示避雨栽培甜樱桃叶片光合色素变化的光谱学分析
张惠敏1,2, 侯黔东2, 吴亚维3, 屠凯2, 李权4, 文晓鹏1,2,*
1.贵州大学林学院/贵州省森林资源与环境研究中心, 贵州 贵阳 550025
2.贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550025
3.贵州省农业科学院果树科学研究所, 贵州 贵阳 550006
4.凯里学院, 贵州 凯里 556011
*通讯作者 e-mail: xpwengzu@163.com

作者简介: 张惠敏, 女, 1987年生, 贵州大学林学院博士研究生 e-mail: mhz722@126.com

摘要

为提高甜樱桃果实的品质和产量, 中国南方地区普遍采用了避雨栽培甜樱桃果树来避免其坐果率低、 落果以及果实畸形等问题, 但同时也导致了其光合作用受到影响。 植物或藻类中的叶绿素和类胡萝卜素等光合色素在光收集和介导对各种内源性刺激的应激反应中起着不可替代的作用。 为便捷快速检测果树光合作用中叶片的光合色素变化, 采用拉曼光谱(Raman spectra)和傅里叶红外光谱(FTIR)对避雨和露地栽培的甜樱桃叶片进行了研究。 经测定和分析甜樱桃叶片200~3 500 cm-1范围的Raman光谱, 对400~800, 800~1 250和1 250~1 650 cm-1三个波数段特征峰值的标定和指认, 结果表明: 甜樱桃叶片对拉曼散射较敏感区主要在500~1 700 cm-1波段内。 960~1 800 cm-1范围类胡萝卜素(番茄红素、 β-胡萝卜素和叶黄素)的Raman光谱包含4条主要峰, 分别为1 526, 1 157, 1 005和960 cm-1; 露地栽培的甜樱桃叶片Raman强度明显低于避雨栽培。 1 157和1 526 cm-1同样还是叶绿素的Raman光谱特征峰, 总体分析表明露地比避雨栽培甜樱桃叶片中的光合色素含量更低。 1 157, 1 520和1 526 cm-1特征谱线对应C—C单键和C=C双键的对称伸缩振动, 其相对强度可以作为甜樱桃叶片内叶绿素、 类胡萝卜素等光合色素以及纤维素含量的判断依据。 FTIR表征叶绿素的振动峰位振动强度弱, 振动耦合复杂, 难以指认。 通过对甜樱桃叶片化学组分FTIR光谱图进行二阶导数求导处理凸显了峰的位置, 提高了图谱的分辨率。 峰位在1 437和1 551 cm-1的β-胡萝卜素的特征峰明显, 露地栽培相比避雨栽培甜樱桃叶片这两个特征峰的吸光度偏小, 表明露地栽培甜樱桃叶片中的β-胡萝卜素含量比避雨栽培要少。 该研究为不同栽培模式下植物叶片光合色素的光谱学研究提供了参考。

关键词: 类胡萝卜素; 叶绿素; 甜樱桃; 特征峰
中图分类号:S66-3 文献标志码:A
Spectral Analysis of Changes in Photosynthetic Pigment Composition in Leaves of Sweet Cherry Tree Under Rain-Shelter Cultivation Based on Raman and FTIR
ZHANG Hui-min1,2, HOU Qian-dong2, WU Ya-wei3, TU Kai2, LI Quan4, WEN Xiao-peng1,2,*
1. College of Forest/Institute for Forest Resources & Environment of Guizhou, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
2. Institute of Agro-bioengineering/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education), Guizhou University, Guiyang 550025, China
3. Institute of Fruit Tree Research, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China
4. Kaili University, Kaili 556011, China;
*Corresponding author
Abstract

To improve the of quality and yield of sweet cherry fruits, sweet cherry trees were cultivated under rain-shelter to avoid the problems of low fruit setting rate, falling fruit and fruit malformation in southern China. Sweet cherry trees under rain-shelter cultivation had an obvious negative effect on photosynthesis. In both plants and algae, photosynthetic pigments such as chlorophylls and carotenoids play irreplaceable roles in light harvesting and mediating stress responses to a variety of endogenous stimuli. This research aimed to detect changes of photosynthetic pigments in leaves that affect photosynthesis of fruit trees quickly and conveniently. The experiment took sweet cherry leaves in two different cultivation pattern, open-field and rain-shelter cultivation, as the research objects, and determined its Raman spectrum in the range of 200~3 500 cm-1. The analysis is performed, and the characteristic peaks are calibrated and designated from three wave number bands of 400~800, 800~1 250 and 1 250~1 650 cm-1. According to the Raman spectrum characteristic value, it is concluded that the sweet cherry leaves have a relatively small Raman scattering. Sensitivity is mainly concentrated in the 500~1 700cm-1 band. The analysis of Raman spectrum in the range of 960~1 800 cm-1 found that characterizes the carotenoids (lycopene, β-carotene and lutein) mainly contains 4 main peaks, which are 1 526, 1 157, 1 005 and 960 cm-1, the Raman intensity of leaves of sweet cherry tree under open-field cultivation is significantly lower than that of rain-shelter cultivation. 1 157 and 1 526 cm-1are also the Raman spectrum characteristic peaks of chlorophyll. Overall analysis shows that photosynthetic pigment content in leaves of sweet cherry under open-field cultivation is lower than that of under rain-shelter cultivation. The characteristic spectral lines of 1 157, 1 520 and 1 526 cm-1 correspond to symmetrical stretching vibrations of C—C single bond and C=C double bond, and their relative strengths can be used as the basis for judging the content of cellulose, carotenoids and chlorophyll in sweet cherry leaves. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) characterizes that the vibration peak position and vibration intensity of chlorophyll are weak, the vibration coupling is complex and difficult to identify. The second derivative treatment of the infrared spectrum of the chemical composition in sweet cherry leaves was used to derive the peak position and enhance the resolution of the spectrum. The characteristic peaks of β-carotene at 1 437 and 1 551 cm-1 are obvious. Compared to rain-shelter cultivation, sweet cherry leaves showed lower absorbance at these two characteristic peaks, indicating that the content of β-carotene in leaves sweet cherry tree under open-field cultivation is less than that of rain-shelter cultivation. These findings provide the theoretical basis for the spectroscopy research of photosynthetic pigments in plant leaves under different cultivation pattern.

Keyword: Carotenoids; Chlorophyll; Prunus avium L.; Characteristic peak
引言

拉曼光谱被广泛用于检测植物各部位的叶绿素、 类胡萝卜素、 矿物质、 纤维素、 木质素、 蛋白质以及鉴定纺织品中的植物源花青素染料等。 类胡萝卜素(包括β -胡萝卜素和γ -胡萝卜素等)是一类重要的天然色素, 在植物生长发育和哺乳动物有机体健康中均起重要作用。 光合色素在植物中的分布及其摄入后对人体健康的作用是当今研究的热点。 因此, 很多学者对类胡萝卜素和叶绿素进行了大量研究, 在植物生长阶段如何快速检测这些光合色素已经取得了阶段性成果。 当前的研究表明拉曼光谱法可以定性分析番茄、 胡萝卜、 芒果等水果中的类胡萝卜素, 通常在532 nm谱线的共振条件下, β -胡萝卜素在1 512 cm-1处表现出强烈的v2(C=C)平面内伸缩的表面增强拉曼光谱特征[1]。 另外, 拉曼光谱分析也可以无损快速检测出植物叶片, 特别是茶叶中的类胡萝卜素[2, 3]。 结合液质联用等仪器和统计学分析计算方法还可以对植物中的叶绿素含量进行定量分析[4, 5]。 可见拉曼光谱分析能够快速检测植物中部分光合色素等物质[6, 7], 但针对植物叶片中光合色素的系统性光谱分析和应用研究则较少。 传统色谱检测光合色素的方法预处理过程繁琐、 检测成本高、 周期长、 设备昂贵。 为快速、 灵敏、 简便检测影响果树叶片光合作用的光合色素变化, 获得结构信息, 将拉曼光谱(Raman)和傅里叶红外光谱(FTIR)应用于不同栽培模式甜樱桃果树叶片的检测分析, 揭示了避雨栽培导致的弱光胁迫影响甜樱桃叶片中叶绿素和类胡萝卜素等光合色素的变化特征, 为甜樱桃果树叶片的光合作用光谱学研究提供了重要信息。

1 实验部分
1.1 材料

甜樱桃(Prunus avium L.)“ 萨米脱” 叶片采集自贵州省农业科学研究院果树科学研究所在贵阳市乌当区百宜镇的果树试验基地(N27° 03'3.89″, E106° 25'47.23″), 采集时间为2019年7月。 避雨设施为2014年4月建成的连栋大棚。 萨米脱为5年生(2015年3月定植1年生嫁接苗), 砧木为“ 吉塞拉6号” (Gisela 6), 株行距2.0 m× 4.0 m, 树形为纺锤形。 避雨栽培和露地栽培分别选择3株生长正常、 生长势相对一致的植株, 每株采样树的东、 西、 南、 北四个方向各取发育枝中部成熟、 健康的叶片20片。

1.2 仪器与参数

利用激光显微拉曼光谱仪(型号为Invia Reflex, 英国Renishaw公司生产)在中等激光强度50 mW、 激发波长532 nm、 曝光时间3 s、 无偏振检测的条件下采集甜樱桃叶片粉末的拉曼光谱。 采集范围为100~3 500 cm-1, 分辨率0.2 nm, 共2049个数据点, 用Origin8.0对图谱数据进行整理。

用美国热电公司生产的 Nicolet380傅里叶变换红外光谱仪扫描获取红外吸收光谱图, 扫描次数为32次, 采集范围为300~4 000 cm-1, 分辨率为4 cm-1

1.3 方法

甜樱桃叶片粉末试样的制备: 采集的甜樱桃叶片通常在0.5 h内会因为水分的流失出现卷叶现象, 由于无法在短时间内将新鲜的现场采摘叶片立即进行拉曼光谱的采集分析, 因此选择将甜樱桃叶片在105 ℃下杀青30 min, 再调整温度到80 ℃烘干至恒重后经研磨和筛分机分离得到40~60目粉末, 放置于阴凉干燥处保存待测。 将避雨和露地栽培的甜樱桃叶片试样分别进行三次生物学重复。

2 结果与讨论
2.1 甜樱桃试样中类胡萝卜素的拉曼光谱分析

对避雨与露地栽培的甜樱桃叶片拉曼光谱进行比较。 从图1中可看出6个露地和避雨栽培甜樱桃叶片Raman特征峰均出现1 526 cm-1处的C=C伸缩振动, 1 157 cm-1处的C— C伸缩振动以及1 005 cm-1处的CH3平面内摇摆振动[8]

图1 露地和避雨栽培甜樱桃叶片的拉曼光谱图
1, 2, 3为露地栽培试样; 4, 5, 6为避雨栽培试样
Fig.1 Raman spectra of leaves of sweet cherry tree under open-field cultivation and rain-shelter cultivation
1, 2, 3: Open-field cultivation; 4, 5, 6: Rain-shelter cultivation

2.2 拉曼光谱的预处理

受外界影响, 直接采集拉曼光谱数据中包含自体背景光(样本中的荧光)、 噪声和弱的拉曼信号。 为消除干扰信息和基线偏移、 随机噪声和背景等因素, 对数据进行预处理从而提高信号质量。 用Wire3.2软件归一化处理原始谱, 包括波数校准、 宇宙射线去除、 降低荧光的影响以及基线扣除等。 经预处理后甜樱桃叶片试样拉曼光谱信号如图2所示, 2 000 cm-1之后波动为去基线造成。 为更好地分析露地栽培与避雨栽培叶片的拉曼光谱, 分别从400~800, 800~1 250和1 250~1 650 cm-1共3个波数段进行特征峰值标定(见图3)。

图2 经过背景扣除预处理后的拉曼光谱图
1, 2, 3为露地栽培试样; 4, 5, 6为避雨栽培试样
Fig.2 Raman spectra of leaves after pre-treatment
1, 2, 3: Open-field cultivation; 4, 5, 6: Rain-shelter cultivation

图3 露地与避雨栽培甜樱桃叶片拉曼光谱对比谱图
1, 2, 3为露地栽培试样; 4, 5, 6为避雨栽培试样
Fig.3 Comparison of Raman spectra of leaves of sweet cherry with rain-shelter cultivation and open-field cultivation
1, 2, 3: Open-field cultivation; 4, 5, 6: Rain-shelter cultivation

经光谱图库对照指认, 从图2和图3可看出, 避雨栽培和露地栽培的同一品种的甜樱桃叶片的Raman谱走势基本一致, 比较明显的特征峰包括1 526, 1 520, 1 157, 1 005, 960和831 cm-1等, 但露地栽培较避雨栽培甜樱桃叶片的谱峰较弱。 这是由于甜樱桃果树受到不同的光照、 温度、 湿度等气候环境影响, 两种栽培模式下的甜樱桃叶片必然存在一些明显的差异。

2.3 光合色素变化分析

类胡萝卜素是四萜化合物, 作为一种天然色素, 在自然界中扮演着重要作用, 能够将吸收的激发态能量转移到叶绿素。 另外, 作为食品还能保护血管, 可避免斑块和血管病变的产生, 对人体健康有益。 根据碳骨架的不同, 常见的类胡萝卜素包括纯线性的番茄红素(lycopene), β 胡萝卜素(β -carotene)和叶黄素(lutein)等。 图2显示了类胡萝卜素(番茄红素、 β -胡萝卜素和叶黄素)拉曼光谱的4条主要峰, 分别为1 526, 1 157, 1 005和960 cm-1, 分别标记为ν 1ν 4

1 500 cm-1处的ν 1拉曼谱带是由共扼的-C=C-双键伸缩振动产生。 1 520 cm-1属于ν 2(C=C)平面内伸缩, 表征类胡萝卜素(β -胡萝卜素和角黄素等), 该处避雨栽培的甜樱桃叶片拉曼特征峰强度高于露地栽培, 整体谱线的变化幅度较大, 相对强度存在明显差异。 在1 157 cm-1拉曼位移的ν 2拉曼谱带是由C— C单键与C— H振动引起。 甲基的振动与相邻C— H耦合产生了ν 3谱带。 1 157 cm-1对应ν 1(C— C)伸缩振动/ C=C平面内伸缩同样是甜樱桃叶片纤维素的特征拉曼光谱。 1 005 cm-1为甜樱桃叶片光谱的ν 3(在1 000 cm-1)拉曼谱带。 露地相比避雨栽培的甜樱桃叶片在1 005 cm-1处谱峰强度变弱。 处于ν 4的谱带起源于— CH基团向共轭多烯链平面外的弯曲振动程度和C=C扭转模式耦合而成。

另外, 748 cm-1为DNA, 831 cm-1对应酪氨酸, 919 cm-1为羟基脯氨酸, 991 cm-1是苯丙氨酸, 1 188 cm-1是反对称磷酸盐振动, 1 272 cm-1由木质素的拉曼散射产生。 1 249~1 254 cm-1为不饱和脂肪酸的特征峰带, 而1 332 cm-1是糖类物质的特征峰, 其拉曼峰与纤维素有关。 1 434~1 441 cm-1附近的拉曼峰可能是由一些酯类聚合物(胆固醇及其脂质)产生[9]。 金克霞[10]对植物细胞壁的Raman应用进展分析指出, 1 594和1 599 cm-1是S型和G型木质素结构单元的特征峰。 木质素官能团振动引起的拉曼特征峰相对其模型物拉曼特征峰的峰位发生了偏移, 因此通常将芳香环伸缩振动引起的1 600 cm-1左右处的特征峰归属为木质素。 从图3(c)可看出, 露地栽培和避雨栽培两种模式对甜樱桃叶片中的木质素含量影响不大。

叶片是植物光合作用的重要器官, 叶绿素含量变化在很大程度上反应了植物光合作用的强弱。 由汪得凯[11]实验观测值与已有的叶绿素a和b振动频率的实验值可知, 1 157和1 526 cm-1不仅是类胡萝卜素的特征峰, 同样也是叶绿素的拉曼光谱特征峰。 1 157和1 526 cm-1为甜樱桃叶片拉曼光谱叶绿素(叶绿素a和b)外卟琳环中的C— O— C和ν 2C=C平面内双键伸缩引起的特征峰。 C=C平面内双键伸缩是处于水分填充的非晶体固态振动, 为叶绿素a和b的特征谱线。 叶绿素和类胡萝卜素含量与叶片生长发育过程中所处环境有关。 与露地栽培相比, 避雨栽培所使用的的塑料棚膜降低了棚内光照强度, 这样一个相对的弱光环境减少了色素的光氧化伤害, 使得叶绿体的基粒层垛叠变高[12], 最后引起甜樱桃叶片中叶绿素含量上升, 可见叶绿素含量的增加是植物对弱光胁迫的一种生态适应性。 因此, 避雨栽培下的甜樱桃叶片会产生更多光合作用相关的叶绿素以及类胡萝卜素等化学成分, 有助于叶片捕获更多的光能。 1 157, 1 520和1 526 cm-1特征谱线对应C— C单键和C=C双键的对称伸缩振动, 其相对强度可作为甜樱桃叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量的判断依据。

2.4 傅里叶变换红外光谱图的特征分析及表征

FTIR为分子振-转光谱, 不仅能够提供丰富的峰位、 峰强和峰形信息, 还可以比较不同样品的红外光谱差异, 解析物质分子内部的综合信息, 从而科学、 准确、 快速地鉴别甜樱桃叶片化学组成上的差异程度。 具有分析速度快、 专属性强、 用样量少、 快速和无需提取与分离的优点。

甜樱桃叶片中有多种色素, 因此其FTIR显示的是混合物的吸收峰, 有谱峰叠加现象。 对比两种不同栽培模式的甜樱桃叶片FTIR[图4(a)]可看出两种样品在500~1 800和2 800~3 500 cm-1波段呈现出明显的官能区特征峰, 整体上二者光谱吸收趋势相似, 差异小。 对所测得光谱原始数据进行基线校正, 标记峰位置, 二阶导数求导处理, 可得到甜樱桃叶片的二阶导数图[图4(b)和(c)]。 在600~1 200和1 200~1 800 cm-1波数范围内的二阶导数图谱不但给出了确切的峰位置, 同时提高了图谱的分辨率。 主要吸收峰集中在621, 784, 1 075, 1 245, 1 321, 1 437, 1 551, 1 636, 1 742, 2 856, 2 927和3 403 cm-1。 其中3 403 cm-1处, 避雨栽培的吸光强度要大于露地栽培。 而在1 636, 1 551, 1 437, 1 321, 1 245, 1 075, 784和621 cm-1处则是露地栽培的吸光强度要大于避雨栽培。 在2 856和1 742 cm-1处两种栽培模式的甜樱桃叶片吸光强度相当。 3 403 cm-1吸收峰强而宽为N— H及缔合的醇羟基O— H伸缩振动峰ν (N— H)ν (O— H)。 2 918 cm-1附近的吸收峰可能为饱和烃— CH2— 反对称伸缩振动。 2 900 cm-1附近为— CH3和— CH2— 的振动。 2 856 cm-1为亚甲基C— H对称和反对称伸缩振动。 1 742 cm-1归属为酯羰基C=O的伸缩振动。 1 636 cm-1附近的吸收峰可能为C=O或不饱和C=C的伸缩振动峰。 1 622 cm-1为C— C伸缩振动。 2 927, 1 636和1 428 cm-1是植物蛋白酰胺的Ⅰ 带和Ⅲ 带峰。 1 379和1 437 cm-1处中等吸收分别归属为甲基— CH3和亚甲基— CH2— 的弯曲振动。 1 398 cm-1吸收峰可能为— CH2— 伸缩振动峰。 1 060和1 075 cm-1处较强吸收为C— O— C(醚键)伸缩振动。 1 033和1 075 cm-1等处为饱和脂肪醚、 酸酐类C— O— C基团特征吸收。 621和784 cm-1附近归属为C— H, 是糖类物质的弯曲振动。 900~1 200 cm-1范围强峰主要是多糖吸收区。 根据文献可知, 叶绿素a的羧基(C=O)振动峰位在1 650~1 740 cm-1之间, 卟啉环上的C=C耦合振动位于1 600 cm-1附近, 与镁离子-配体有关的振动处于250~650 cm-1之间[13], 这一段振动强度弱, 振动耦合复杂, 难以指认。 β -胡萝卜素的变化特征明显, 吸收峰包括1 437 cm-1烯烃C— H基团振动的吸收峰以及1 551 cm-1的芳香环骨架振动。 露地相比避雨栽培甜樱桃叶片在这两个特征峰表现为吸光度偏小, 说明露地栽培甜樱桃叶片中的β -胡萝卜素含量比避雨栽培的要少。 可见利用FTIR能够快速便捷地鉴定和比较不同栽培模式下甜樱桃叶片的光合色素方面的光谱学特征。

图4 甜樱桃叶片红外光谱图
1: 露地栽培试样; 2: 避雨栽培试样(a): FTIR图; (b): 二阶导数FTIR图(1 200~600 cm-1); (c): 二阶导数FTIR图(1 800~1 200 cm-1)
Fig.4 Infrared spectra of sweet cherry leaves
1: Open-field cultivation; 2: Rain-shelter cultivation (a): FTIR; (b): Second derivative (1 200~600 cm-1); (c): Second derivative(1 800~1 200 cm-1)

3 结论

Raman研究表明避雨栽培导致甜樱桃叶片中与光合作用相关的叶绿素, 类胡萝卜素等的官能团发生了变化, 由于叶片生长微环境的改变, 使得叶绿素、 β -胡萝卜素分子含量受到影响。 避雨栽培甜樱桃在低光照的胁迫下通过增加叶片中的色素比例捕获更多的光能来维持原有的光合速率, 因此避雨栽培比露地栽培甜樱桃叶片中表征叶绿素以及类胡萝卜素的拉曼光谱强度要高, 其含量也就更大。

FTIR分析结果显示栽培模式对甜樱桃叶片中的叶绿素、 类胡萝卜素含量影响显著, 避雨相比露地栽培甜樱桃叶片中的光合色素含量更大。

有关避雨栽培导致光照减弱、 温度、 湿度变化等小气候环境的改变对甜樱桃叶片叶绿素以及类胡萝卜素含量变化的形成机制还需要进一步研究。

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