十年生倾斜生长的黑杨(Populus nigra)采自西北农林科技大学植物园, 树高16 m、 胸径14.5 cm, 枝下高7.3 m。 在距基部5 m处茎部倾斜部分的上端及下端分别截取受拉木及对应木木块(15 mm× 5 mm× 10 mm)。 蒸馏水反复冲洗后, 利用滑走切片机(Leica RM2010R, Germany)切取厚度为20 μ m的样品横切面备用, 切片时所使用的刀片为Leica 810。

利用单面刀片将受拉木与对应木样品块切成火柴棒大小, 经梯度丙酮逐级脱水, 进行低黏度Spur树脂浸渍、 包埋及固化。 采用超薄切片机(Leica EM-UC6)连续切取90 nm的超薄切片, 然后置于过滤后的1%(w/v)高锰酸钾水溶液染色1 min, 蒸馏水反复冲洗, 自然晾干后在JEM-1230(JEOL)透射电子显微镜下进行显微成像, 成像时加速电压为80 kV。

将获取的20 μ m厚横切面切片置于载玻片上自然晾干后, 采用重水(D₂O)(原子百分比99.9%, Sigma-Aldrich)预浸渍1 h后, 盖薄片封片, 采用共聚焦显微拉曼光谱仪(LabRamXplora, Horiba Jobin Yvon)进行光谱采集。 激发波长532 nm, 到达样品的激光功率为8 mW。 测试时光栅为300 mm^-1, 狭缝宽度为100 μ m, 扫描步距为0.5 μ m, 单点光谱采集时间为1.5 s, 光谱测定范围为3 100~300 cm^-1, 光谱分辨率为2 cm^-1。 光谱采集时采用100倍油镜(Plan N 100× , Oil, NA=1.0), 获得的数据利用LabSpec6软件采用线性偏最小二乘法进行批量矩阵成像数据基线校正后归一化处理, 进而实现特征峰峰面积成像叠加。

对比对应木[图1(a)]与受拉木[图1(b, c)]TEM图像发现两者的纤维细胞壁分层结构存在明显差异, 主要体现在次生壁的亚层组成及厚度差异。 与对应木次生壁三亚层结构(外层S₁(0.5~1.0 μ m), 中层S₂(3.0~5.0 μ m), 内层S₃(0.05 ~0.12 μ m))不同, 受拉木的纤维次生壁仅分为S₁(0.2~0.5 μ m)及S₂(2.0~3.5 μ m)且厚度较小, 在其次生壁S₂内侧还含有电子密度较低的胶质层(gelatinous layer, GL), 该层厚度约为1.2~2.5 μ m。 以上差异反映出受拉木纤维细胞因抵抗拉伸应力而产生的形变。

图1

Fig.1

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	图1 对应木(a)与受拉木(b, c)纤维细胞分层结构TEM图像Fig.1 TEM images showing the layering structure of opposite wood (a), tension wood (b) and higher magnification of tension wood (c)

本研究中所使用的显微拉曼光谱仪的空间分辨率约为0.5 μ m, 在受拉木细胞角隅胞间层, 次生壁以及胶质层能够准确地抽取相应区域的平均拉曼光谱(图2), 涉及特征峰主要出现在2 942 cm^-1(纤维素、 半纤维素及木质素— CH非对称伸缩振动), 2 897 cm^-1(碳水化合物— CH, — CH₂伸缩振动), 2 476 cm^-1(O— D伸缩振动), 1 598 cm^-1(木质素芳香环对称伸缩振动), 1 094 cm^-1(纤维素C-O-C非对称伸缩振动), 904 cm^-1(木聚糖)等波数区^{[11, 12, 13]}。

图2

Fig.2

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	图2 受拉木纤维细胞不同形态区域拉曼光谱比较Fig.2 Average Raman spectra extracted from various morphological regions of tension wood

2.3.1 细胞壁形态及主要组分分布相关性

通过对2 942 cm^-1纤维素、 半纤维素及木质素— CH非对称伸缩振动特征峰进行积分, 获得的拉曼光谱成像图中受拉木[图3(a)]与对应木[图3(b)]纤维细胞角隅胞间层(CCML)、 复合胞间层(CML)、 次生壁(S)及受拉木中特有的胶质层(GL)区域清晰可见, 且受拉木部分纤维细胞的细胞腔区域发生了明显的形变[图3(a)中三角形所示细胞]。

作为阔叶木细胞壁中的主要组成成分, 纤维素构建了细胞壁的“ 骨架” , 半纤维素及木质素分别构成了细胞壁的基体物质和结壳物质, 并填充于纤维素“ 骨架” 之中。 本研究分别对三大主要组分进行特征峰1 094 cm^-1(纤维素)、 1 598 cm^-1(木质素)、 904 cm^-1(半纤维素木聚糖)峰面积积分成像, 并进行两两相互叠加探索其空间分布相关性。 叠加的木质素与纤维素, 木质素与木聚糖的显微拉曼光谱成像图表明三大组分在受拉木和对应木细胞壁不同形态区域中均有分布, 但各组分之间的分布相关性存在一定差异。 受拉木胶质层沉积了高浓度的纤维素(红)并存在一定浓度分布较均一的木聚糖(绿)。 在次生壁区域, 纤维素在受拉木每对应木中呈现均一分布但浓度明显低于胶质层; 木聚糖在受拉木次生壁中分布浓度普遍高于对应木, 且在次生壁临近胞间层一侧及胞间层中更为集中; 木质素仅在受拉木紧邻胞间层的次生壁区域呈现一定浓度分布, 这可能是细胞壁通过木质素的沉积从而增加刚度以抵抗外界拉伸应力而导致的。 在胞间层区域, 受拉木和对应木的主要成分均为木聚糖和木质素, 其中, 木聚糖在受拉木中的分布浓度普遍高于对应木, 而木质素在两者细胞角隅胞间层浓度最高。 受拉木和对应木不同形态区域三大组分浓度差异详见表1。 可以看出, 受拉木在形成过程中对纤维素与木聚糖的分布浓度产生了较大的影响, 在整个细胞壁形态区域中, 两者较对应木均呈现增强的趋势, 这可能与拉伸应力作用下纤维细胞壁中纤维素和半纤维素等链状分子的形变与分子间距的缩小而导致的单位面积内分子浓度增加有关。

图3

Fig.3

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	图3 受拉木(a)与对应木(b)纤维细胞形态拉曼光谱成像Fig.3 Raman images showing the cell wall morphology of tension wood (a) and opposite wood (b)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 受拉木和对应木不同形态区域三大组分浓度差异 Table 1 The variation in the components concentration within the morphologically distinct cell wall of tension wood and opposite wood 形态区域 纤维素分布浓度 木聚糖分布浓度 木质素分布浓度 受拉木 对应木 受拉木 对应木 受拉木 对应木 胶质层 高 - 低 - 极低 - 次生壁 中 中 高 中 低 极低 复合胞间层 低 极低 高 中 中 中 细胞角隅胞间层 低 极低 中 低 高 高

表1 受拉木和对应木不同形态区域三大组分浓度差异 Table 1 The variation in the components concentration within the morphologically distinct cell wall of tension wood and opposite wood

2.3.2 相邻细胞壁线扫描分析

为了揭示受拉木与对应木纤维细胞壁主要组分沿各自相邻细胞壁的浓度梯度变化规律, 本研究针对木质素芳香环伸缩振动(1 598 cm^-1)、 纤维素C— O— C非对称振动(1 094 cm^-1)和木聚糖C— O— C(904 cm^-1)进行相邻细胞壁线扫描(图5), 所提取的线扫描区域如图4(a)和(c)中所示虚线区域。 从图中可以看出沿着细胞腔向复合胞间层区域过渡时, 受拉木与对应木木质素、 纤维素和木聚糖浓度均呈现明显的区域选择性及梯度变化规律, 与表1结果一致。 在细胞壁沿胶质层向复合胞间层方向, 受拉木纤维素浓度呈下降趋势, 木质素和木聚糖浓度呈上升趋势; 在细胞壁沿次生壁向复合胞间层方向, 对应木纤维素浓度呈下降趋势, 木质素浓度呈上升趋势, 木聚糖浓度变化趋势不明显。

图4

Fig.4

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	图4 受拉木(a, b)和对应木(c, d)纤维细胞壁中木聚糖(绿)、 木质素(蓝)及纤维素(红)空间分布相关性拉曼光谱叠加图Fig.4 Overlaid Raman images showing the topochemical correlation between lignin (blue) and cellulose (red) as well as lignin (blue) and xylan (green) in tension wood (a, b) and opposite wood (c, d)

图5

Fig.5

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	图5 受拉木(a— c)与对应木(d— f)中相邻纤维细胞壁中木质素(a和d), 纤维素(b和e)和木聚糖(c和f)浓度变化拉曼线扫描图Fig.5 Raman line scan showing the variation in lignin (a and d), cellulose (b and e) and xylan (c and f) along the adjacent fiber wall in tension wood (a— c) and opposite wood (d— f)

2.3.3 受拉木与对应木细胞壁孔隙分布

木材细胞壁孔隙测定的传统方法主要借助气体的吸附脱附法, 其获得的研究结果通常为样品孔隙的平均信息^{[3, 9, 14]}, 未能在更为微观的细胞壁乃至细胞壁亚层角度揭示受拉木与对应木的孔隙分布差异性。 针对传统研究的不足, 本研究采用D₂O预浸渍的组织切片结合原位高空间分辨显微拉曼成像对受拉木细胞壁各层中的D₂O浓度分布规律进行研究, 分别对受拉木与对应木中D₂O特征峰2 476 cm^-1峰面积积分成像(图6)。 图中黄色区域为细胞腔空腔区域, 其高浓度的D₂O分布在一定程度上证实了该方法用于表征纤维细胞孔隙结构的适用性。 同时可以看出, 沿细胞腔经过胶质层向复合胞间层区域过渡时, 受拉木和对应木中D₂O的浓度均呈现逐渐降低的梯度变化规律, 且前者更为明显。 在受拉木中, 胶质层D₂O浓度明显高于次生壁及胞间层, 表明了胶质层的孔隙结构分布密集, 而对应木中的D₂O在次生壁及胞间层均有较高浓度的分布且明显高于受拉木相应区域。 以上发现证实了受拉木孔隙主要来源于胶质层^[9]。 同时可以推断, 由于拉伸应力的作用受拉木次生壁及胞间层孔隙结构发生一定程度的压缩, 而胶质层由于一侧紧邻细胞腔而大大减弱所受的外力作用从而利于多孔结构的生成。

图6

Fig.6

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	图6 受拉木(a)与对应木(b)中相邻纤维细胞壁中D2O分布拉曼成像图Fig.6 Raman image showing the concentration distribution of D2O along the adjacent fiber wall in tension wood (a) and opposite wood (b)