研究所使用的主要化学试剂, 均来源于商业购买, 且使用时均未进一步纯化。 硒粉(Selenium, Se), 分析纯, 98%, 上海阿拉丁试剂公司; 二水合醋酸锌(Zinc acetate dehydrate, ZnAc₂· 2H₂O), 分析纯, 98%, 国药试剂有限公司; 谷胱甘肽(L-glutathione, GSH), 分析纯, 98%, 阿拉丁试剂公司; 硼氢化钠(Sodium borohydride, NaBH₄), 分析纯, 98%, 阿拉丁试剂公司。

稳态吸收光谱数据的采集是使用紫外-可见分光光度计(TU1901, 北京普析通用仪器有限责任公司)。 仪器可在190~900 nm波长范围内进行探测, 波长准确度± 0.3 nm。

稳态荧光光谱采用的是Horiba公司生产的FluoroMax4型荧光光谱仪, 稳态荧光光谱激发波长为298 nm, 狭缝宽度设定为光谱分辨率1 nm/1 nm。 因为不同波长光源的发射功率不一样, 且探测器在不同波长下的探测效率也不一样, 所以我们在检测样品的稳态荧光光谱时选用S1c/R1c。

时间分辨荧光光谱的采集使用的时间相关单光子计数(TCSPC)设备为我们课题组自行搭建^[13], 实验中使用的激发光源为半导体脉冲激光器(PDL 800-B, PicoQuant), 中心波长为298 nm, 功率为1 μW, 重复频率为10 MHz, 系统仪器响应时间分辨率为200 ps。

(1)ZnSe量子点的合成及提纯

ZnSe量子点的合成主要参照Zhang等^[14]的研究工作, 通过水热合成法合成出了以谷胱甘肽作为配体的水溶性ZnSe量子点, 合成所用Zn²⁺:Se⁺:GSH为1:0.4:1.3。 将22 mg硼氢化钠和700 μL水加入5 mL的玻璃瓶中, 向其中加入15.8 mg硒粉, 使之充分反应, 得到硒氢化钠溶液。 再将109.75 mg醋酸锌和200 mg谷胱甘肽溶于20 mL水中, 用1 mol· L^-1的氢氧化钠调节pH值到11.5, 将反应制得的硒氢化钠溶液加入其中, 混合溶液在100 ℃油浴下, 磁力搅拌加热2 h, 制得ZnSe量子点原液。 将所合成的ZnSe量子点原液, 加入1.5倍体积的异丙醇, 以8 000 r· min^-1离心3 min, 去除上层清液, 将所得白色固体真空干燥, 得到提纯后的ZnSe量子点固体并保存于4 ℃冰箱中, 以备后续实验使用。

(2)ZnSe量子点的表征

取上述制备的ZnSe量子点固体1 mg, 加入去离子水并稀释至1 mmol· L^-1(以Zn²⁺浓度计), 得到ZnSe量子点溶液。 取1 mL所配制的ZnSe量子点溶液, 使用稳态荧光光谱仪和紫外吸收可见分光光度计测量其荧光光谱和吸收光谱。

取200 μL所配制的ZnSe量子点溶液, 滴在超薄微型铜网上, 晾干后, 采用透射电子显微镜对其形貌特征进行表征。

(3)ZnSe量子点在不同pH值中及与Na⁺相互作用的光谱表征

分别取所配制的不同pH值的0.2 mol· L^-1的PBS缓冲液2 mL, 依次向其中加入配制的浓度1 mmol· L^-1的ZnSe量子点溶液200 μL, 摇匀, 静置2 min后, 采用稳态荧光光谱仪和时间单光子计数分别采集其荧光光谱和时间分辨荧光光谱。 取两份2 mL的pH值为7的PBS缓冲液, 并分别向其中加入200 μL量子点溶液, 然后, 向其中一份加入200 μL配制的1.8 mol· L^-1的NaCl溶液, 另一份加入200 μL去离子水, 分别摇匀, 静置2 min后, 分别测定其时间分辨荧光光谱。

图1为ZnSe量子点吸收、 荧光光谱及TEM形貌表征。 从图1(a)可以看出, 所制备的ZnSe量子点荧光发射峰在375 nm附近且半峰宽在20 nm左右, 第一激子吸收峰在360 nm处, 该结果与文献报道吻合。 通过透射电子显微镜观察[图1(b)], 合成的ZnSe量子点近球形, 分散性较好, 粒径尺寸在3 nm左右且分布较集中。 以上结果证明制备出了较好的纳米级ZnSe量子点。

图1

Fig.1

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	图1 ZnSe量子点的荧光及紫外-可见吸收光谱(a)和透射电镜表征图(b)Fig.1 Fluorescence and UV-Vis absorption spectra (a) and transmission electron microscopy characterization of ZnSe quantum dots (b)

通过调节不同pH值的PBS缓冲液, 我们每间隔0.5, 分别测定了5~11范围内不同pH值下ZnSe量子点的稳态荧光光谱, 在此pH值范围ZnSe量子点能够稳定存在, 测量的结果如图2所示。 图2展示了ZnSe量子点不同pH值下的荧光峰, 从图中可以看出, 在所考察的pH值范围内, ZnSe量子点荧光强度随pH值的增加而增强, 变化趋势呈正相关, 并且荧光峰伴随pH值的增加产生稍微的红移, 峰的位置由374 nm移动到377 nm处。 究其原因, 可能是由于在较低pH值下, 表面配体质子化从配体表面脱落, 脱离表面时带走表面原子, 使得量子点尺寸减小, 从而在较低pH值下, 量子点发光峰波长较短。 ZnSe量子点荧光特性随pH值的变化说明pH值对量子点的发光态具有影响, 其机制是不同pH值下, 配体具有不同的状态^{[8, 15]}。 相关文献报道, 由于谷胱甘肽分子在不同pH值下, 其分子内羧基和氨基基团的质子化和去质子化程度不同, 导致谷胱甘肽配体分子在不同pH值下与Zn²⁺的配位结构不同^[14], 使得配体分子对量子点表面的包覆程度不同, 进而使量子点的表面出现不同状态。 当pH值增加时, 谷胱甘肽配体分子更易去质子化, 其与Zn²⁺配位程度将更加紧密, 导致ZnSe量子点表面缺陷态减少, 使得ZnSe量子点荧光强度增加。

图2

Fig.2

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	图2 不同PH值下ZnSe量子点的稳态荧光光谱Fig.2 Steady-state fluorescence spectra of ZnSe quantum dots at different pH values

从ZnSe量子点的稳态荧光光谱可以看出, 其荧光强度随pH值增大而增加。 为此, 我们从荧光动力学的角度考察了pH值对ZnSe量子点荧光特性的影响。 图3是在不同pH值下, ZnSe量子点在发射波长为375 nm处的时间分辨荧光动力学曲线。 从图中可以看出, ZnSe量子点的荧光寿命随pH值的增加变小。 对不同pH值下得到的荧光动力学曲线我们通过双指数函数可以得到很好的拟合

I(t)=α1e-t/τ1+α2e-t/τ2(1)

图3

Fig.3

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	图3 ZnSe量子点在不同pH值下的荧光衰减曲线Fig.3 Fluorescence decay curves of ZnSe quantum dots at different pH values

拟合得到两个荧光寿命组分, 分别为一个大约为24 ns的长寿命组分τ ₁和一个大约为4 ns的短寿命组分τ ₂, α ₁和α ₂分别为荧光寿命组分的振幅, 并通过式(2)

< τ> =α1τ12+α2τ22α1τ1+α2τ2(2)

计算得到了整体的平均寿命^[16]。 图4(a)为平均寿命随pH值的变化曲线, 可以看出, ZnSe量子点的平均寿命随pH值的增加而呈减小趋势, 且pH值在6~8的范围内, 其平均寿命随pH值的改变最为明显, 出现一个较大幅度的衰减。 从图4(b)中可以看出, 长寿命τ ₁随pH值的变化曲线和平均寿命变化曲线一致, 而短寿命τ ₂随pH值的变化不明显, 但总体有上升的趋势。 另外, 从表1中可以看出, τ ₁组分占比下降, τ ₂组分则占比上升, 且同样在6~8的pH值范围内出现一个较显著的变化。 以上实验结果表明, pH值的改变主要影响ZnSe量子点τ ₁所对应的荧光衰减组分, 且在6~8的pH值的范围内, ZnSe量子点的荧光寿命对pH值的响应较为灵敏。

图4

Fig.4

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	图4 ZnSe量子点平均寿命(a)和两种荧光寿命组分(b)随pH值的变化曲线Fig.4 Fluorescence average lifetime (a) and two lifetimes (b) vs. pH values

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 拟合得到的各组分的荧光寿命及其振幅 Table 1 Fluorescence lifetimes and amplitudes of each component at different pH values pH α 1 τ 1/ns α 2 τ 2/ns < τ > /ns 5 0.65 31.8 0.35 4.3 29.8 6 0.64 30.5 0.36 4.4 28.6 6.5 0.62 28.5 0.38 4.4 26.5 7 0.61 26.9 0.39 4.3 24.9 7.5 0.60 26.0 0.40 4.4 23.9 8 0.60 25.3 0.40 4.5 23.2 9 0.60 24.9 0.40 4.8 22.6 10 0.59 24.1 0.41 4.8 21.8 11 0.59 23.9 0.41 4.9 21.5

表1 拟合得到的各组分的荧光寿命及其振幅 Table 1 Fluorescence lifetimes and amplitudes of each component at different pH values

为了确认拟合得到的两个不同的寿命的来源, 我们进一步考察了pH值分别为6, 7和8的环境下, 不同探测波长的荧光动力学并进行拟合得到荧光寿命, 其结果展示于图5。 在三种pH值下, ZnSe量子点的τ ₁均随探测波长的增加而增大, 而τ ₂与波长的相关性不大。 Zhao等^[17]的研究结果证实, 量子点的长寿命会随波长的变化而变化, 而短寿命则不依赖于波长的改变而改变。 τ ₁的来源为表面态的局域载流子的复合, 而τ ₂则来源于核内非局域载流子的复合^{[16, 17]}。 以上分析进一步说明, pH值对量子点表面态产生了显著影响进而导致量子点的荧光特性的改变。 对于ZnSe量子点来说, 由于表面谷胱甘肽配体对pH值敏感, pH值的改变会导致谷胱甘肽配体的质子化程度的变化, 从而影响与量子点表面的配位方式, 导致其表面状态的改变^[6]。 当pH值减小时, 谷胱甘肽配体质子化, 导致其与ZnSe量子点表面Zn²⁺配位紧密程度下降, 从而导致其表面态的增加, 载流子将更多的迁移到表面, 使得τ ₁组份增加。 另外, 由于实验所测量的荧光衰减曲线包含辐射弛豫和无辐射弛豫, 是两种弛豫方式综合叠加的结果, 所以荧光衰减寿命由辐射跃迁速率Γ _r和无辐射跃迁速率F_nr来表示

τ=1Γr+Γnr(3)

图5

Fig.5

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	图5 pH值为6, 7, 8时ZnSe量子点稳态荧光光谱及荧光寿命随发射波长的变化曲线Fig.5 Steady-state fluorescence spectra and fluorescence lifetimes of ZnSe quantum dots vs. emission wavelength when pH value is 6, 7 and 8

辐射和非辐射跃迁速率的改变都会影响整体荧光寿命的改变。 通过稳态荧光实验得到, 当pH值增加时, ZnSe量子点荧光强度上升, 说明其辐射跃迁速率Γ _r上升, 且无辐射跃迁速率Γ _nr下降^[18]。 根据式(3)并结合时间分辨荧光光谱实验结果分析得出, pH值的增加使ZnSe量子点表面态辐射跃迁速率的增加量要大于无辐射跃迁速率的减小量, 从而ZnSe量子点表面态荧光寿命随pH值的增加而减小。

由于ZnSe量子点荧光寿命对pH值的变化具有响应, 我们对拟合得到的两种不同的寿命组分进行比值τ ₁/τ ₂计算, 发现其比值在不同的pH值范围内随pH值的变化具有一定的线性相关性, 结果展示于图6。 从图中可以看出, 在不同pH值范围内, τ ₁与τ ₂的比值所呈的线性斜率不同, 在pH为6~8的范围内, 其随pH值变化的线性斜率最大(k=-0.63, R²=0.993), 说明在此范围内ZnSe量子点的寿命对pH值的变化最为灵敏, 可作为pH值探针应用于生物体系中。

图6

Fig.6

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	图6 ZnSe量子点荧光寿命τ 1与τ 2的比值随pH值的变化Fig.6 The ratio τ 1/τ 2 of ZnSe quantum dots vs. pH value

另外, 生物体系中由于存在多种金属离子, 需要考察这些金属离子是否会对量子点荧光寿命产生影响。 为此我们研究了生物体系中存在最多的金属钠离子Na⁺对ZnSe量子点荧光寿命的影响。 由于生物体系pH值一般在7附近, 为了与生物体系相符合, 我们在pH值为7的环境下, 测定了有无NaCl时, ZnSe量子点溶液的荧光动力学, 拟合得到平均寿命分别为24.7和24.9ns, 两者寿命差别不大, 表明Na⁺对ZnSe量子点的荧光寿命影响较小。 另据文献报道, 其他金属离子对ZnSe量子点会产生猝灭效应, 但其猝灭方式为静态猝灭^{[19, 20]}, 因此说明金属离子对ZnSe量子点的荧光寿命影响不大。 综上分析, ZnSe量子点荧光寿命对pH值的响应作为一种pH值的检测方法应用在生物体系中具有一定的潜力。