当光波作用在物质上时, 物质内部的电子将吸收光子能量, 产生从基态跃迁至激发态的电子能级跃迁, 在电子能级跃迁的过程中伴随着振动能级和转动能级跃迁, 因此, 紫外可见吸收光谱为“ 带状光谱” 。 电子能级跃迁所需能量较大, 一般会落在紫外可见区域(200~800 nm)。 电子跃迁符合量子化规则, 因此紫外-可见吸收光谱具有“ 指纹性” 特征, 可以利用紫外-可见吸收光谱对物质做定性定量分析。 研究中对优化完成的多肽的结构进行激发态的单点能计算, 得到与实验值波长范围相同的所有激发态能级的跃迁能, 获得分子的紫外-可见吸收光谱^[12]。

光学吸收或发射过程中, 荧光是由自旋允许的单重态到单重态的跃迁发射产生。

S1→S0+hv(3)

分子荧光的强度受分子结构中的刚性平面影响较大, 在组成多肽的多种氨基酸中, 具有荧光效应的主要是三种芳香族氨基酸(色氨酸, 酪氨酸, 苯丙氨酸), 三种氨基酸中均存在的离域π 键, 其荧光主要由π → π ^* 辐射跃迁产生。 多肽类物质的荧光发射符合Kasha规则, 对于荧光光谱的计算, 通过优化多肽分子第一激发态(S₁)的结构, 根据S₁结构的分子前线轨道, 预测荧光发射波长的范围; 计算第一激发态到基态的跃迁能, 得到分子的荧光光谱。

通过DFT方法优化GHRP-6和Oxytocin两种肽气相的几何结构, 优化得到的几何结构见图2(a), 图3(a), 对优化后的结构进行振动分析, 确认没有虚频, 表明该结构为基态最稳定的结构[图2(b)]。 GHRP-6含有6个氨基酸残基, Oxytocin含有9个氨基酸残基。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 GHRP-6优化后的分子结构图(a)和振动光谱图(b)Fig.2 Optimized structures (a) and Vibration spectrum (b) of GHRP-6

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 催产素优化后的分子结构图与振动光谱图Fig.3 Optimized structures and Vibration spectrum of Oxytocin

根据优化后的结构, 得到两者多肽中芳香族氨基酸的环与相连原子的二面角, 如表1所示, GHRP-6结构中存在两个荧光贡献基团(色氨酸, TRP), 其二面角更接近平面, Oxytocin上有一个荧光贡献基团(酪氨酸, TYR), 其二面角为14.37° , 与GHRP-6相比, 结构的刚性平面程度和共轭程度更差。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 多肽结构中芳香族氨基酸与相连原子的二面角 Table 1 Dihedral angles between aromatic amino acids and connected atoms in the polypeptide 多肽 GHRP-6 Oxytocin 色氨酸1 色氨酸2 酪氨酸 二面角 7.08° 2.54° 14.37°

表1 多肽结构中芳香族氨基酸与相连原子的二面角 Table 1 Dihedral angles between aromatic amino acids and connected atoms in the polypeptide

以优化完成后的分子结构为对象, 用TDDFT方法计算两种肽类物质的单重态的激发态跃迁能, 得到两种肽类物质的紫外-可见吸收光谱, 并与实验结果进行比较。 通过对比计算结果, 及其他研究者的工作, 得出了以下结论^{[6, 13, 14]}: 当计算对象的体系越大, 刚性平面程度越低时, 应选取Hartree-Fock(HF)交换成份越高的泛函进行计算。 采用不含HF成份的BP86泛函计算6个氨基酸残基的GHRP-6的紫外-可见吸收光谱与实验值吻合程度最高; 采用HF成份为20%的B3LYP计算9个氨基酸残基的Oxytocin与实验值吻合程度最高。 计算结果见图4(a, b)。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 GHRP-6(a)和Oxytocin(b)紫外-可见吸收光谱的计算值和实验值Fig.4 UV-Vis spectra of GHRP-6 (a) and Oxytocin (b) Solid: Calculation results; Short Dash: Experimental results

从图4可以看出, 计算得到的紫外-可见吸收光谱与实验值基本吻合, 实验测得的GHRP-6的紫外-可见吸收光谱最大吸收波长为279 nm, 计算得到的最大吸收波长为282 nm, 误差为3 nm, 误差百分比小于2%[见图4(a)]; Oxytocin紫外-可见吸收光谱的实验值为275 nm, 计算值为269 nm, 误差为6 nm, 误差百分比小于3%[见图4(b)]。 图4(a)中的240~320 nm范围内的吸收峰为GHRP-6的本征吸收峰, 由分子结构中π → π ^* 轨道跃迁产生, GHRP-6分子收到光子激发后, 氨基酸残基中的离域π 键被激发跃迁至反键轨道, 产生279 nm的紫外吸收本征吸收峰; 催产素的紫外-可见吸收光谱中[图4(b)], 主要贡献为结构中酪氨酸上的π → π ^* 轨道跃迁。 在200~240 nm范围内存在的吸收谱带是由于电子跃迁过程中相互碰撞引起二次跃迁产生的, 不属于分子的本征吸收峰。 由此通过实验验证了该方法建立紫外-可见吸收光谱理论模型的准确性和可行性。

采用两种方法计算多肽类物质的荧光光谱: (1)根据分子前线轨道图中芳香族氨基酸的π ^* → π 轨道跃迁间的gap值, 预测分子的荧光峰位置; (2)对单重态第一激发态进行优化, 获得结构的第一激发态到基态的辐射能量, 根据高斯展宽得到多肽类物质的荧光光谱。

通过计算得到GHRP-6, Oxytocin的分子前线轨道能量, GHRP-6中位于色氨酸残基的π ^* → π 轨道跃迁为GHRP-6产生荧光的主要贡献; Oxytocin中位于酪氨酸残基的π ^* → π 轨道跃迁为Oxytocin产生荧光的主要贡献。 如图5(a)所示, GHRP-6中色氨酸残基上的π ^* → π 轨道间的gap值为3.58 eV, 计算得到产生荧光的波长为346 nm, 与实验值360 nm间误差为14 nm, 误差百分比约为4%; 如图5(b)所示Oxytocin中酪氨酸残基上的π ^* → π 轨道间的gap值为4.18 eV, 计算得到产生荧光的波长为296 nm, 与实验值312 nm间误差为16 nm, 误差百分比约为5%。 通过此方法, 可以模拟出分子中产生荧光的主要贡献位置, 在不考虑电子相关的情况下, 可以较为准确的预测出分子发出荧光所在的波长范围, 对分子荧光的理论计算和实验具有指导意义。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 GHRP-6(a)和Oxytocin(b)分子前线轨道的π * → π 跃迁Fig.5 The π * → π transition of the molecular frontier orbital of GHRP-6 (a) and Oxytocin (b)

通过计算得到GHRP-6和Oxytocin从第一激发态跃迁到基态的跃迁能, 通过高斯展宽后得到的荧光光谱。 GHRP-6荧光光谱计算值为368 nm, 实验值为360 nm, 与实验值的误差为8 nm, 误差百分比小于3%; Oxytocin荧光光谱计算值为305 nm, 实验值为312 nm, 与实验值的误差为7 nm, 误差百分比小于3%。 GHRP-6产生荧光的发射波长与色氨酸产生的荧光波长近似, 说明GHRP-6产生荧光的主要贡献为色氨酸残基上的π ^* → π 轨道跃迁, 色氨酸残基与相连原子的二面角为7.08° , 2.54° , 分子的共平面程度较高, 呈现较强的刚性平面结构, 会增加荧光强度。 GHRP-6分子结构受到紫外吸收本征激发光的照射, 分子被激发后, 跃迁至单重第一激发态(S₁)的π ^* 轨道, 当分子跃迁回基态(S₀)的 π 轨道时, 即发出360 nm波长的荧光。 Oxytocin荧光峰位置与酪氨酸产生的荧光波长相似, Oxytocin产生荧光的主要贡献为酪氨酸残基上的π 轨道跃迁, 酪氨酸残基与其相连的原子的二面角为14.37° , 刚性平面程度相比于色氨酸较低, 荧光强度弱于色氨酸。

通过对GHRP-6的激发态计算, 证明可以通过本计算方法针对较大体系的多肽类物质, 计算其激发态下的紫外吸收光谱和荧光光谱, 分析其激发态下电子光谱的发生机理, 且与实验值吻合程度较高, 误差均在5%以内。 由此理论和实验结果验证了采用密度泛函理论计算建立荧光光谱理论模型的可行性。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 GHRP-6(a)和Oxytocin(b)的荧光光谱的计算值和实验值Fig.6 Fluorescence spectra of GHRP-6 (a) and Oxytocin (b) Solid: Calculation results; Short Dash: Experimental results