拉曼光谱(Raman spectroscopy, RS)一直以来都备受重视, 因为不同物质的RS都能显示其不同的特征, 例如物质的分子结构、 振动归属、 结晶度等信息^[1]。 RS在材料、 地质探测、 血液分析、 深海环境等应用广泛^{[2, 3, 4]}。 目前关于RS最新研究: 用RS分析法鉴定生咖啡豆的基因型、 识别咖啡豆感官质量的化学变化^[5]; 用RS快速筛选技术对受污染玉米中的玉米赤霉烯酮进行研究^[6]; 连续石油焦的RS表征对焦炭形态的定量评估^[7]; 用激光闪光RS法表征单个纳米粒子的比热^[8]等。

由于拉曼信号较弱, 提取比较困难, 所以常用的方法是对样品进行表面增强处理, 比较繁琐。 近年来, 人们不断尝试用高分辨率的空间外差光谱仪(spatial heterodyne spectrometer, SHS)来探测RS。 2018年Allen等使用远程LIBS和拉曼SHS在10 m距离处测量各种样品^[9]; 2018年Qiu等用阶梯镜结构开发空间外差拉曼光谱仪(spatial heterodyne Raman spectrometer, SHRS), 并测量了岩石的RS^[10]; 2017年Hu等利用SHS对化学战剂模拟物进行RS检测^[11]。

三叶草是一种可食用的豆科草本植物, 外形优美, 生命力顽强, 是绿化装饰的佳品。 因其在牧草、 保健品、 医学等方面的研发价值, 近年来人们越来越重视对三叶草的研究。 目前主要是研究三叶草的色素含量、 活力指数、 光合荧光特性等^[12]在其他物质影响下的变化, 以及在药用功效: 抗炎、 愈合伤口等^[13]。 而对三叶草RS的研究未见报道, 加之三叶草便于得到, 所以本文选择三叶草进行初步试验, 希翼有助于在保健食品、 医学等方面的研究工作。

本文搭建了基于SHS的RS探测系统, 不用对样品做复杂处理, 能快速、 非接触检测拉曼信号。 首先介绍SHRS检测原理, 接着是对三叶草里主要色素进行理论RS计算, 然后详细说明实验装置与设计, 最后测出了三叶草的RS, 将理论RS与实测RS进行分析对比。 结果表明理论RS与实测RS可以很好的吻合, 证明拉曼探测系统的可行性。 最后分析了产生误差和实测RS强度较弱的原因, 在接下来的工作将对测量系统进行改进, 进行基于SHRS的物质含量定量测试。

RS是一种散射光谱, 光照射到物体会发生能量转移, 进而会产生瑞利散射与拉曼散射。 若入射与散射光的频率分别为ω ₀和ω ₁, 当ω ₀=ω ₁则为弹性散射, 即瑞利散射。 若光子与分子间的能量相互传递, ω ₀会产生变化, 则为非弹性散射。 若hω ₀-hω ₁=hΔ ω , Δ ω 的变化对应于分子的转动能级差, 这一过程称为拉曼散射。 可以用能级理论来解释, 如图1中的红色线和蓝色线都是拉曼散射。

图1

Fig.1

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	图1 拉曼散射原理图Fig.1 Raman scattering schematic

其中红色的称斯托克斯谱线(Stokes), 即ω ₀> ω ₁

ΔE=hω0-hω1(1)

蓝色的又称反Stokes谱线(anti-stokes), 即ω ₀< ω ₁

ΔE=hω1-hω0(2)

通常情况下拉曼信号强度只有瑞利散射光强的千分之一, 信号微弱, 对于精确探测比较困难。 采用SHS作为光谱探测器, 具有超光谱分辨率、 高通量、 无运动部件等优点, 能在被测物质特征波长中心范围探测, 实现微弱光信号的直接测量。 检测原理如图2所示, 样品被激光器照射后, 产生拉曼散射光, 该散射光经透镜准直, 由分束器分成两束相干光, 两相干光束分别被光栅G1, G2以θ 角反向衍射回分束器重新合束, 两合束光在出射面形成干涉条纹, 并由光学成像系统成像在探测器上, 最后对干涉数据进行傅里叶变换可处理出样品的拉曼光谱。 由于SHS探测波段仅覆盖RS强特征光谱范围, 故可以避开瑞利散射光影响。

图2

Fig.2

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	图2 空间外差拉曼检测原理图Fig.2 Space heterodyne Raman detection schematic

SHS与普通光谱仪相比较, SHS更像是光谱仪中的放大镜, 具有更窄的波段范围和更高的光谱分辨率, 其光谱范围一般只有十几或几个纳米, 光谱分辨率可达10^-4 nm。 基于空间外差的RS测量系统测量时只针对目标的最强特征峰进行探测, 因此获取被测样品RS谱峰信息对SHS参数设计与搭建具有指导作用。

理论RS仿真是通过使用Gaussview6.0搭建被测物质的分子结构, 利用Gaussian16^[14]仿真出RS。 三叶草主要的光合色素是叶绿素和类胡萝卜素^[15]。 叶绿素包括叶绿素a与叶绿素b, 类胡萝卜素由胡萝卜素和叶黄素二大类组成。 叶片里类胡萝卜素主要是α -胡萝卜素和β -胡萝卜素, 所以本文选择仿真叶绿素a、 叶绿素b、 α -胡萝卜素和β -胡萝卜素的RS。 它们含量从文献[13]的含量图可以算出, 叶绿素与类胡萝卜素之比大致为10: 1。

首先搭建它们的分子结构, 从图3的优化结构可以看到, 叶绿素a和叶绿素b分子结构的区别在其中一个吡咯环的附加基团上, 从图3(a)和(b)的标注可以看出, 分别是甲基与醛基。 类胡萝卜素是异戊二烯类化合物, α -胡萝卜素和β -胡萝卜素分子结构的差异在于其中一个环己烷上的碳碳双键位置不同, 如图3(c)和(d)的标注所示。 然后对搭好的分子构型进行优化, 最后进行频率计算。 叶绿素分子中C, H和O元素选用DFT/B3LYP/6-31 G基组, Mg元素选用Lanl2DZ基组进行频率计算。 类胡萝卜素分子选用DFT/B3LYP/6-31+G(d, p)基组进行频率计算。

图3

Fig.3

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	图3 四种色素分子优化结构图 (a):叶绿素a; (b): 叶绿素b; (c): α -胡萝卜素; (d): β -胡萝卜素Fig.3 Optimized structure diagram of four pigment molecules (a): Chlorophyll a; (b): Chlorophyll b; (c): α -carotene; (d): β -carotene

优化结构图如图3所示, 所有分子计算后均没有虚频, 说明优化的分子构型很稳定, 仿真结果可信。 修正^[16]后的RS如图4所示。 从图4可以清晰的看出不同谱峰的强度大小, 从中选出最强谱峰附近的波段进行探测。 图4(a)为叶绿素a的理论RS, 可以看出波数为1 662 cm^-1时强度最大, 要测出其附近的四个峰, 即实测1 570~1 747 cm^-1的波段。 图4(b)是叶绿素b的理论RS, 选择实测1 580~1 744 cm^-1的峰段, 其中波数为1 640 cm^-1时谱峰最强。 图4(c)是α -胡萝卜素的理论RS, 从图中可以看出当频率为1 697 cm^-1谱峰最强, 选择测量1 663~16 97cm^-1RS波段。 图4(d)是β -胡萝卜素的理论RS, 从图中可以看出当频率为1 700 cm^-1时, 谱峰最强, 选择测量1 616~1 700 cm^-1RS波段。 通过要测的仿真RS波段和SHS可测的光谱范围, 可以反推出激光器的中心波长, 进而选择合适的激光器, 下面的实验部分会给出具体计算公式。

图4

Fig.4

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	图4 四种色素理仿真RS (a):叶绿素a; (b): 叶绿素b; (c): α -胡萝卜素; (d): β -胡萝卜素Fig.4 Four pigment simulation Raman spectroscopy (a): Chlorophyll a; (b): Chlorophyll b; (c): α -carotene; (d): β -carotene

搭建的物质RS快速、 直接检测系统, 是基于高分辨率的SHS, 将光谱范围设计在近红外, 可以有效的规避荧光; 由于SHS探测波段仅覆盖RS强特征光谱范围, 可以避开瑞利散射光。

图5为物质RS快速、 直接检测系统, 系统由空间外差拉曼探测单元与光谱数据提取单元两部分组成, 其中空间外差拉曼探测单元包括激光器、 被测物、 高分辨率SHS。 光谱数据提取单元由计算机记录干涉图、 光谱提取组成。 具体的RS实测系统如图6所示。 图6中SHS是中国科学院安徽光学精密机械研究所设计的HEP-765-S, 光谱波段范围为759~769 nm, 光谱分辨率优于0.1 nm, 通光孔径< 30 nm, CCD探测器为CCD47-20AIMO(1 024× 1 024)。

图5

Fig.5

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	图5 物质RS直接、 快速检测系统结构图Fig.5 Direct and rapid detection system structure diagram of material RS

图6

Fig.6

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	图6 实验检测系统图Fig.6 Experimental detection system diagram

根据拉曼散射原理, 若SHS的光谱范围为λ ₁~λ ₂, 频率为σ ₁~σ ₂, 样品的仿真RS较强的频率段为σ ₃~σ ₄, 则激光器和被测物质的频率之差的绝对值应该落在SHS的频率范围(σ ₁~σ ₂)内, 即满足式(3)和式(4)

σ4=|σ0-σ1|(3)

σ3=|σ0-σ2|(4)

从图4仿真RS光谱图可以看出, 叶绿素a的较强波段为1 570~1 747 cm^-1, 叶绿素b的较强RS波段为1 580~1 744 cm^-1, α -胡萝卜素较强RS波段为1 663~1 697 cm^-1, β -胡萝卜素较强RS波段为1 616~1 700 cm^-1。 为了测量三叶草RS的较强拉曼波段, 需测出4种色素的较强波段。 利用式(3)和式(4)反推出激光器的中心波长, 选择中心波长为680 nm的激光器较为合适。 因此本文采用了中心波长为680.28 nm的激光器作为激发光源, 最大功率为130 mW。

实验前采摘三叶草, 清洗, 晾干。 测量时首先将三叶草固定在白板上, 让激光器照射三叶草合适的位置, 确保激光器照射位置位于通光孔径的中心。 接着设置采集的积分时间832 ms, 触发时间2 s, 在黑暗条件下进行探测。 先不开激光器测量背景干涉图, 然后打开激光器测量三叶草干涉图。 最后对采集的干涉图进行傅里叶变换, 预处理, 波长定标, 最终得到三叶草的RS, 如图7(a)所示。 激光器的电流强度为0.75 A, 室内温度为24 ℃。

图7

Fig.7

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	图7 (a) 实测RS, (b) 仿真RS合成图, (c)实测的暗背景光谱Fig.7 (a) Measured Raman spectrum, (b) Simulated Raman spectrum composite diagram, (c) Measured dark background spectrum

利用搭建的物质RS快速、 直接检测系统, 对三叶草进行初步试验, 得到的RS如图7(a)所示。 图7(b)是理论仿真光谱图, 按4种色素含量的比例, 将光谱强度进行调整, 最后拟合成一个光谱图。 对比图7(a)和(b)可以看出, 三叶草的实测RS是叶子内各种色素的叠加包络。 仿真图7(b)里最左边的谱峰(波数为1 550 cm^-1)有上升趋势, 与实验图7(a)谱峰上升的位置一致; 仿真图7(b)中间波段(1 620~1 715 cm^-1)的较高的谱峰所形成的包络与实测光谱中间的凸起吻合较好。 仿真图7(b)中最右边1 750 cm^-1的谱峰, 实验图中相对应的位置有明显下降的趋势。 通过与仿真光谱比较, 实测光谱在使用空间外差系统探测波段正好是三叶草叶片内主要色素RS信号叠加的包络, 中央主峰与两端次峰都符合较好, 实测光谱与仿真光谱具有较好一致性, 说明采用空间外差系统对物质拉曼信号进行直接检测具有可行性。

图7(c)是实测的仪器暗背景光谱, 在一条缓慢上升的基线上叠加了一系列细脉冲信号, 这主要是由SHS探测器的热噪声构成。 当系统在探测到目标拉曼信号后, 这些热噪声仍然存在, 但在快速傅里叶变换处理后强度有所减弱, 如图7(a)中的小尖峰所示。 另一方面实测图中拉曼信号强度总体较弱, 这主要是两方面原因造成: 一是由于所用激光器的功率峰值偏小, 约为130 mW; 二是所用HEP-765-S空间外差光谱系统为一体化设计仪器, 软硬件系统及参数固化后不能进行调整, 仪器数据采集的最大积分时间为832 ms。 光源功率不够大且仪器积分时间小共同导致采集信号偏弱。

介绍了一种基于SHS的RS快速、 直接探测系统, SHS可测的光谱范围为759~769 nm, 搭配不同的激光器, 可以实现同一目标的不同波段RS或不同目标的拉曼特征峰探测。 利用仿真出的RS, 得到物质特征光谱, 也为激光器的选择提供依据。 初步试验是测量三叶草的RS, 首先理论计算了三叶草中的主要色素: 叶绿素a、 叶绿素b、 α -胡萝卜素和β -胡萝卜素理论RS, 接着根据SHS可测的光谱范围和四种色素的理论RS较强特征波段, 选择680.28nm的激光器作为激发光源, 最后实测出三叶草的RS。 结果表明实测图与仿真图很吻合, 证明了测量系统的可行性。 实验中测量RS信号的强度稍弱, 这主要是两方面原因造成: 一是由于所用激光器的输出功率偏小, 约为130 mW; 二是由于使用的SHS系统积分时间不可调且积分时间短造成。 光源功率不够大且仪器积分时间小共同导致采集信号偏弱。 后面我们将对测量系统进行改造或重新搭建, 进行基于SHRS的物质含量定量测试。