农药是指以促成农作物成长, 保障农作物健康为目标而生产出的化合物。 近年来农药中毒事件频出, 引发人们的持续关注。 敌百虫(Trichlorfon), 是一种适用于谷类作物上咀嚼式口器害虫防治的有机磷农药, 它能抑制胆碱酯酶, 造成神经生理功能紊乱, 兼有触杀作用和渗透活性^[1]。 若敌百虫的过量使用, 会造成农药的残留污染, 对人畜安全构成一定威胁, 影响人体的器官功能, 甚至会增加畸形、 基因突变和DNA损伤的发病率, 同时对哺乳动物的生殖及神经细胞具有明显的毒副作用^[2]。

为了保证土壤和食品的安全, 现已开发出多种检测各种基质中农药残留的方法, 其中以免疫法和色谱-质谱联用法的使用较为常见。 Liu等^[3]使用免疫法测定了果蔬中的敌百虫和毒死蜱, 敌百虫的检出限达到了19 μg·L^-1, 添加回收率为77.8%~92.0%。 Sun等^[4]使用色谱-质谱联用法测定了6种常见的有机磷农药(敌百虫、 灭线磷、 乐果、 杀螟硫磷、 对硫磷和倍硫磷), 该方法对敌百虫的检出限为0.12 μg·L^-1, 定量限为0.41 μg·L^-1。 这些方法需要复杂的预处理和专业人员的操作, 耗时耗力的同时还会对实验样品造成损害。 因此, 急需探索一种简单、 快速及无损的农药残留检测方法用于敌百虫残留的检测。

太赫兹波, 在电磁波谱中处在微波和红外线之间, 其频率范围为0.1~10 THz, 对应的波长范围是30~3 000 μm。 太赫兹辐射的能量很低, 不会引起待测物的有害电离反应, 从而为化学和生物样品的无损检测提供了可能^[5]。 此外, 许多分子的转动和振动模式都位于太赫兹波段, 因此太赫兹光谱包含了丰富的分子结构信息^[6]。 由于太赫兹波的独特性质, 目前, 太赫兹光谱已被应用于生物医学诊断^[7]、 环境检测^[8]和食品分析^[9]等多个领域。 太赫兹时域光谱技术是太赫兹光谱中最常用的一种分析方法, 已被应用于葡萄糖^[10]、 盐酸^[11]、 氨基酸^[12]和抗生素^[13]等方面的检测。 太赫兹频域光谱是近两年才发展起来的一种太赫兹光谱技术。 相比太赫兹时域光谱技术, 太赫兹频域光谱具有能够直接记录样品的透射信号、 无需傅里叶变换和分辨率相对较高的优点。 因此, 太赫兹频域光谱在检测领域更具应用潜力。

本研究使用太赫兹频域光谱检测了土壤中的敌百虫。 首先采集敌百虫纯品在0.9~2.1 THz频段的光谱, 分析得到了它在该频段的三个特征吸收峰(1.18, 1.55和1.91 THz)。 同时借助密度泛函理论计算敌百虫分子的振动频率, 并与实验结果进行比对验证, 从而对敌百虫特征吸收峰的来源进行了解释。 采集了土壤中不同含量敌百虫的太赫兹光谱, 并利用化学计量学中的偏最小二乘算法建模, 通过相关系数, 校正均方根误差、 预测均方根误差和交叉验证均方根误差来评价模型的性能, 证明了太赫兹频域光谱技术结合化学计量法对土壤中敌百虫含量检测的可行性。

实验所用敌百虫样品(99%, CAS: 52-68-6)购置于广州市左克生物科技发展有限公司, 土壤样品取自青岛崂山。

敌百虫纯品压片的制备: 称量一定量的敌百虫样品, 转移至研钵中充分研磨, 然后称取200 mg样品, 使用压片机(HY-12, 天津天光光学有限公司)在12 MPa的压力下持续施压两分钟使其成为厚度约1 mm直径为13 mm的圆形薄片。

土壤纯品压片的制备: 称量一定量的土壤样品, 转移至研钵中充分研磨后称取200 mg样品, 使用压片机在12 MPa的压力下持续施压两分钟使其成为厚度约1 mm直径为13 mm的圆形薄片。

敌百虫-土壤混合物压片的制备: 称量一定量的敌百虫样品, 转移至研钵中充分研磨, 备用; 称量一定量的土壤样品, 转移至研钵中充分研磨, 备用。 分别称量一定量的研磨后的敌百虫样品和土壤样品, 充分混合均匀, 使得混合物的总质量为200 mg, 且其中敌百虫的含量分别为0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%和50%。 将每一份的混合物样品用压片机在12 MPa的压力下持续施压两分钟使其成为厚度约1 mm直径为13 mm的圆形薄片。 为了减少操作误差, 每个含量的混合物样品制备三个压片。

采用太赫兹频域光谱系统(TERASCAN 1550, TOPTICA Photonics Inc, Germany)来对样品进行光谱测量。 该系统主要由DLC智能电子设备、 光纤耦合铟镓砷光混频器和分布式反馈二极管激光器等组成。 如图1所示, 太赫兹信号通过连续拍频产生, 从抛物面镜准直, 再透过被测样品被抛物面镜聚焦到接收器上, 然后转移至信号处理系统加以处理即可得到样品的相关光谱信息。 选择频率范围为0.86~2.26 THz, 扫描步长为0.04 GHz。 由于水对太赫兹光的强烈吸收, 整个实验过程在室温状态室内湿度保持在4.0%以下。

图1

Fig.1

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	图1 太赫兹频域光谱系统原理图Fig.1 The schematic diagram of THz-FDS system

样品的吸收率α 可由式(1)得到

α=-lgT(1)

其中, T为透过率, 可由样品和参考的光电流振幅比较计算所得。

分子的太赫兹吸收峰来源于太赫兹波与分子中原子或官能团的振动/旋转之间的共振吸收^[14]。 基于密度泛函理论的理论计算, 可以观察每个吸收峰对应的振动/转动模式, 从而对吸收峰进行解释。 因此利用密度泛函理论的B3LYP/6-31G(d)基组对敌百虫分子进行了计算, 以研究敌百虫吸收峰的来源。

化学计量学是指利用运用数学、 统计学以及其他相关学科的理论和知识, 来完成实验设计与优化和样品的检测与分析^[15]。 使用化学计量学中的偏最小二乘法算法(partial least squares, PLS)建立模型^[16], 将所有样品用于校正集和预测集, 通过模型的相关系数, 校正均方根误差、 预测均方根误差和交叉验证均方根误差来评判模型的性能。 良好的模型应该具有较为接近1的相关系数, 较低的校正均方根误差、 预测均方根误差和交叉验证均方根误差。

采用Gaussian软件对敌百虫分子建立结构如图2所示。 为了借助可视化窗口对敌百虫分子进行吸收峰的来源分析, 我们先对敌百虫分子中所有原子进行标号, 其中, 序号1, 8, 9和17为碳原子, 序号5, 7, 13和15为氧原子, 序号2, 3, 4, 10, 11, 12, 14和16为氢原子, 序号18, 19和20为氯原子, 序号6为磷原子。

图2

Fig.2

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	图2 敌百虫分子结构图Fig.2 Molecular structure of trichlorfon

图3(a)为通过理论计算得到的敌百虫分子的振动模式(红线)以及通过实验测试得到的敌百虫压片的吸收光谱(黑线)。 其中, 红线的高度代表了振动的强弱。 图3(a)可见, 在理论计算中, 敌百虫分子有两个振动模式, 分别位于1.59和1.94 THz处, 其中1.59 THz处的振动较强。 而实验测试得到敌百虫存在三个特征吸收峰, 分别位于1.18, 1.55和1.91 THz处, 其中1.18 THz处的特征峰的强度最大, 吸光度达到约2.95; 1.91 THz处特征峰的强度次之, 吸光度为2.04; 而1.55 THz处的特征峰的强度最弱, 吸光度只有1.90。 对比理论和实验计算结果可以发现, 理论计算得到的1.59 THz对应于实验测试得到的1.55 THz处的吸收峰; 理论计算得到的1.94 THz对应于实验测试得到的1.91 THz处的吸收峰。 通过Gaussian软件可视化窗口观察发现1.59 THz处的振动模式来源于9, 10, 11与12号原子组成的甲基的摇摆振动; 而1.94 THz处的振动模式来源于17, 18, 19与20号原子的旋转振动。 值得注意的是, 实验得到的1.18 THz处的吸收峰在理论计算中没有得到, 分析认为原因是理论计算的模型是单分子结构, 得到的振动模式是分子内的作用力形成的; 而实验的对象是晶体结构, 得到的吸收峰除了分子内作用力, 还有分子间作用力的影响。 因此, 可以推测实验中1.18 THz处的吸收峰是由分子间的相互作用力形成的。 此外, 在理论计算中1.94 THz处的振动较1.59 THz处的强一些, 但是实验中1.91 THz处的吸收峰稍弱于1.55 THz处的吸收峰, 该现象也归因于上述原因。 由以上结果分析可知, 敌百虫在该频段的三个特征吸收峰比较明显的(1.18, 1.55和1.91 THz), 可以作为对敌百虫的定性检测的依据。 土壤纯品压片的吸收谱如图3(b)所示。 分析认为, 土壤在0.9~2.1 THz频段没有出现特征吸收峰。 随着频率的增加, 土壤的吸光度也逐渐增加, 吸光度值的范围在0.87~2.33。 整条谱线呈现倾斜的背景, 这是因为土壤颗粒对太赫兹散射的影响^[17]。 因为在1.0~1.5 THz频段, 敌百虫是有特征吸收峰的, 而土壤没有表现处吸收峰, 因此推测, 在土壤基质中鉴别敌百虫是可以实现的。

图3

Fig.3

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	图3 敌百虫纯品(a)与土壤基质(b)的吸收谱Fig.3 Absorption spectra of (a) trichlorfon and (b) soil

为了验证太赫兹频域光谱技术可以实现土壤中的敌百虫残留检测的设想, 采集了敌百虫-土壤混合物压片的吸收光谱。 由于1.18 THz处的吸收峰相比其他两个吸收峰较清晰而又易于辨认, 因此选择该吸收峰附近的1~1.5 THz频段对敌百虫-土壤混合物压片的吸收光谱进行分析, 如图4所示。 在1~1.5 THz范围内, 所有光谱都有倾斜的背景基线, 这是因为土壤的吸收导致的。 在整个频段内, 可以清楚区分敌百虫含量大于或等于20%的压片样品, 且随着含量的增加, 吸光度增加。 在1.18 THz处, 可以清楚区分敌百虫含量大于或等于10%的压片样品, 且随着含量的增加, 峰值处的吸光度增加。 而敌百虫含量低于或等于5%的压片样品的吸收光谱没有出现1.18 THz处的特征吸收峰, 吸光度值的变化也没有规律。 分析认为在敌百虫含量低的压片中, 土壤在混合样品中占据主导地位, 而由图3可知土壤的吸光度高于敌百虫的吸光度, 从而土壤的光谱特性掩盖了敌百虫的吸收特性, 因此无法鉴别土壤中敌百虫含量低于或等于5%的压片样品。

图4

Fig.4

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	图4 不同浓度敌百虫在土壤中的吸收光谱Fig.4 The absorption spectrum of different contents of trichlorfon in soil

研究中借助化学计量学方法来进一步对土壤中敌百虫含量进行分析。 由于实验环境的微小变化和其他情况都可能对实验结果造成影响, 对全部实验结果加以研究可能导致误差或者增加额外的工作量, 因此选取主成分分析方法来降低数据的维数。 考虑到敌百虫的特征峰和高信噪比信号, 选取1 174.44~1 193.24 THz频段的光谱进行偏最小二乘法建模, 如图4虚线框所示。 该模型包含8个含量的24个压片样本。

其中17个样本(8个浓度, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%和50%)作为校正集, 剩余7个样本(5个浓度, 5%, 10%, 20%, 30%和40%)作为预测集。 模型分析结果如图5所示。 图5(a)中, 对角虚线表示为预测值和实际值差值为0, 模型的预测集和校正集均靠近对角虚线, 表现了预测集和校正集之间良好的线性关系。 图5(b), 虚线表示零误差线, 误差度范围为-0.04~0.04, 模型的误差较小。 该模型具有相对较高的相关系数(> 0.993 04), 较低的校正均方根误差(< 0.021 9)、 预测均方根误差(< 0.024 6)和交叉验证均方根误差(< 0.028 6)。

图5

Fig.5

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	图5 偏最小二乘法模型对土壤中的敌百虫含量的预测Fig.5 Content prediction of trichlorfon in soil by PLS model

提出了一种基于太赫兹频域光谱技术结合化学计量学检测土壤中敌百虫含量的新方法。 通过使用太赫兹频域光谱技术得到了敌百虫样品的吸收峰分别为1.18, 1.55和1.91 THz, 其中吸光度最大的吸收峰在1.18 THz, 在1.55 THz的吸收峰吸光强度最弱。 将敌百虫分子的理论计算的吸收峰与实验吸收峰进行了比对, 对敌百虫的吸收峰来源进行了解释, 证实了实验的准确性。 对不同含量的敌百虫-土壤混合样品光谱的研究发现, 1.18 THz处的吸光度随着敌百虫的含量的增加而增大, 对混合样品使用偏最小二乘法建模, 模型获得了满意的结果(R> 0.993 04, RMSEC< 0.021 9, RMSEP< 0.024 6, RMSECV< 0.028 6)。 结果表明, 该方法可以有效对土壤中的敌百虫进行定性和定量分析。 证明了太赫兹频域光谱技术结合化学计量学方法在土壤的农药残留检测中极具应用潜力, 从而为环境检测提供了一种新思路。