引用本文
朱单单, 瞿鹏, 孙闯, 杨媛, 刘道胜, 申琦, 郝远强. 一种基于苯并噻唑的长波长双响应性荧光探针对粘度与H2O2的检测 [J]. 光谱学与光谱分析, 2020,40(6): 1775-1779.
ZHU Dan-dan, QU Peng, SUN Chuang, YANG Yuan, LIU Dao-sheng, SHEN Qi, HAO Yuan-qiang. A Benzothiazole-Based Long-Wavelength Fluorescent Probe for Dual-Response to Viscosity and H2O2 [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2020,40(6): 1775-1779.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2020)06-1775-05  
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一种基于苯并噻唑的长波长双响应性荧光探针对粘度与H2O2的检测
朱单单1,2, 瞿鹏2,*, 孙闯2, 杨媛2, 刘道胜1,*, 申琦3, 郝远强2,*
1. 辽宁石油化工大学化学化工与环境学部, 辽宁 抚顺 113006
2. 河南省新能源电池材料工程技术研究中心, 河南省先进电池材料开发应用研究中心,河南生物分子识别与传感重点实验室, 商丘师范学院化学化工学院, 河南 商丘 476000
3. 郑州大学化学与分子工程学院, 河南 郑州 450001
*通讯联系人 e-mail: qupeng0212@163.com; dsliu05@126.com; hao0736@163.com

作者简介: 朱单单, 女, 1995年生, 辽宁石油化工大学化学化工与环境学部硕士研究生 e-mail: 2648159666@qq.com

收稿日期: 2019-05-28
基金: 国家自然科学基金项目(21804085)资助
摘要

H2O2是一种常见的生物活性小分子, 其在细胞增殖, 炎症反应, 细胞信号传输等过程中都起着重要的作用。 细胞粘度是一项重要的生理微环境参数, 其为细胞是否正常运转的关键指标。 研究还表明, 一些重大的生理疾病与细胞组织的粘度及过氧化氢浓度异常均有着密切的关联, 如阿尔茨海默病、 癌症。 因此开发能有效同时检测H2O2及粘度的分析方法对揭示相关生理病理机制及重大疾病的诊断有着重要的意义。 研制了一种能有效检测H2O2与粘度的双响应型荧光探针(1)。 由于存在扭曲分子内电荷转移(TICT)的猝灭效应, 探针(1)几乎不具有荧光发射特性。 而随着环境体系粘度的增高, TICT效应被抑制, 探针(1)呈现出了强的荧光发射, 且发射峰位于近红外波段处(680 nm)。 随着粘度从1.996 cp增至851.8 cp, 探针的荧光强度增幅达到了85倍。 探针还能对H2O2产生灵敏的荧光响应, 发射峰位置在590 nm处。 响应原理为H2O2能与探针中的苯硼酸基团反应使探针脱除掉与吡啶氮原子相连的亚甲基苯硼酸, 从而减弱了探针分子中的TICT效应以及分子内电荷转移(ICT)效应, 因此探针溶液荧光发射显著增强且探针溶液的紫外光谱发生了明显的蓝移(吸收峰从540 nm移至460 nm), 对应溶液颜色从红色变为黄色。 荧光光谱测试表明探针(1)对H2O2的检测具有高的选择性与灵敏度, 探针体系在590 nm处的荧光强度与H2O2的浓度呈良好的线性关系, 线性范围为0~25 μmol·L-1, 根据IUPAC的3σ法计算得出检测限为0.34 μmol·L-1。 此外细胞荧光成像实验表明探针(1)具有较好的生物相容性及细胞膜通透性, 且能实现细胞内H2O2的成像分析。

关键词: 荧光探针; 过氧化氢; 粘度; 近红外; 苯并噻唑
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
A Benzothiazole-Based Long-Wavelength Fluorescent Probe for Dual-Response to Viscosity and H2O2
ZHU Dan-dan1,2, QU Peng2,*, SUN Chuang2, YANG Yuan2, LIU Dao-sheng1,*, SHEN Qi3, HAO Yuan-qiang2,*
1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Environmental Engineering, Liaoning Shihua University, Fushun 113006, China
2. Henan Engineering Center of New Energy Battery Materials, Henan D&A Engineering Center of Advanced Battery Materials, Henan Key Laboratory of Biomolecular Recognition and Sensing, College of Chemistry and Chemical Engineering, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China
3. College of Chemistry and Molecular Engineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
*Corresponding authors
Abstract

Hydrogen peroxide (H2O2) is an important biological molecule and plays vital roles in cell growth, immune responses, and cell signaling pathways. Cellular viscosity is a significant physiological parameter and also indicates the normal or abnormal functions of cells. Moreover, both abnormal levels of H2O2 and cellular viscosity are found to be highly related to some major diseases, such as Alzheimer’s disease and cancers. Therefore, the development of effective analytical tools for simultaneously detecting H2O2 and cellular viscosity is of great significance to elucidating some critical physiological and pathological mechanisms, as well as the diagnosis of some relevant diseases. In this work, we developed a dual-responsive fluorescent probe (1) for viscosity and H2O2. Probe (1) is almost non-fluorescent due to the quenching effect arisen from the twisted intramolecular charge transfer (TICT) process within the probe. While the probe exhibited strong near-infrared fluorescence (~680 nm) in solution with high viscosities, which can be attributed the restricted TICT process. The turn-on fluorescence reached 85 folds with the solution viscosity increased from 1.996 cp to 851.8 cp. Furthermore, probe (1) also can sensitively response to H2O2 with the evolution of a new emission band at about 590 nm. H2O2 can effectively react with the phenylboronic acid moiety of probe (1) and result in the conversion of pyridinium unit to pyridine, which could attenuate the ICT (intramolecular charge transfer) and TICT effects of the probe, and thus lead to a dramatic increase in the fluorescence intensity as well as a blue-shift in absorption profile (from 540 to 460 nm) with the observed color of the solution changed from purple-red to yellow. Fluorescence measurements indicated that probe (1) is highly sensitive and selective for H2O2. The fluorescence intensity of the probe assay at 590 nm was found to vary linearly with the concentration of H2O2 in the range of 0~25 μmol·L-1, the detection limit was calculated to be 0.34 μmol·L-1 (3 σ). Furthermore, cellular imaging experiment confirmed that probe (1) is highly biocompatible and cell-membrane permeable, and can be utilized for monitoring H2O2 in living cells.

Keyword: Fluorescent probe; Hydrogen peroxide; Viscosity; Near-infrared; Benzothiazole
引言

过氧化氢(H2O2)是一种重要的生理活性含氧分子, 而且其他活性氧的产生与代谢过程也常需要H2O2的参与[1]。 研究表明过氧化氢的非正常水平与多种疾病相关, 如炎症性疾病、 心血管疾病、 神经组织退化疾病和癌症[2, 3]。 另一方面, 粘度作为细胞正常运转的重要指标参数, 能反映细胞内生物分子的信号传导, 营养物质和代谢废物的运输况状。 研究发现细胞粘度的变化和过氧化氢的非正常水平也与许多疾病有关[4]。 开发一种简单可靠的方法实现粘度及过氧化氢的同时检测对相关疾病的诊断及病理机制的研究有着重要的意义。

众所周知, 荧光成像分析方法具有高灵敏度、 无创检测、 实时分析、 时空分辨率高等特点, 已应用于多种物质的检测[5, 6]; 能对多个检测对象具有不同光谱信号通道响应的单一分子荧光探针体系有诸多优点, 如分析程序简单、 减少光谱串扰、 避免反应产物对另一个探针检测的影响[7, 8, 9, 10, 11, 12]。 而能够同时检测粘度和过氧化氢水平的荧光探针分子还鲜有报道[13]。

基于上述考虑, 开发了一种基于苯并噻唑的具有长波长至近红外发射特性的双响应性荧光探针(1), 探针对H2O2的识别基团为苯硼酸结构单元[14], 探针对粘度的响应机制为随着体系粘度的增高探针分子的扭曲分子内电荷转移(TICT)过程逐渐被抑制, 从而探针分子的荧光发射增强。 探针(1)具有如下优点: 对目标物均为长波长的增强型荧光响应, 有利于减低背景荧光的干扰, 对H2O2的响应荧光波长在590 nm附近, 对粘度的响应波长为680 nm; 探针体系具有较大的斯托克斯位移值有利于消除激发光的干扰, 对H2O2与粘度响应的斯托克斯位移值分别为: 140与230 nm; 探针具有良好的生物相容性可用于细胞成像分析。

1 实验部分
1.1 试剂与仪器

2-氨基苯硫(安耐吉), 其他试剂(2-羟基-5-甲基苯甲醛, 乌洛托品, 4-溴甲基苯硼酸, 三氟乙酸, 4-甲基吡啶)均为阿达玛斯试剂。 所有的水溶液均使用Millipore的纯水(18 MΩ ·cm-1)配置。

CPA224S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司); IKA®C-MAG HS7 电磁搅拌器(德国IKA公司); ZF-Ⅱ 型四用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂); IKA®RV 10旋转蒸发仪(德国IKA公司); BRUKER AV400核磁共振仪(德国BRUKER公司); Waters Acquity UPLC H-Class系统(美国Waters公司); Lambda 850紫外可见分光光度计(美国PerkinElmer公司); LS55荧光光谱仪(美国PerkinElmer公司); ZeissLSM710激光扫描共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)。

1.2 光谱测试

1.2.1 紫外光谱

选择DMSO-PBS体系, 在配置的反应液中探针浓度为10 μmol·L-1, DMSO所占比例为50%, 溶液pH为7.4, 磷酸缓冲溶液的浓度为10 mmol·L-1, 选择DMSO-PBS体积比为1:1的溶液作为参比溶液。

1.2.2 荧光光谱测试

用DMSO溶解探针配置成母液待用, 测试体系中探针浓度为10 μmol·L-1。 H2O2母液用去离子水稀释配置, 通过移取不同体积的H2O2母液配置成一系列浓度梯度的待测液, 在激发波长为450 nm下检测其荧光发射强度, H2O2和粘度荧光检测的激发及发射狭缝宽度分别为2.5和5 nm。 探针与H2O2的反应时间为3 h。

1.3 细胞实验

将培养的A549细胞与探针(1)(10 μmol·L-1)、 和依次与H2O2 (100 μmol·L-1)及探针(1) (10 μmol·L-1)在37 ℃时在DMEM (Dulbecco’ s modified Eagles medium)溶液中孵育。 培育时间均为3 h。 培育后用PBS缓冲液冲洗所培育的细胞3次以除去多余探针分子及金属离子。 细胞用共聚焦荧光显微镜进行成像(红色通道)。

1.4 探针(1)的合成

探针(1)的合成流程如图1所示, 其中苯并噻唑4及其醛基化衍生物3的合成参见文献[15]。 化合物2由4-溴甲基苯硼酸与4-甲基吡啶在无水乙腈中在回流反应得到。

图1 探针(1)的合成路线图Fig.1 Synthetic route for probe 1

将化合物2 (0.200 g, 0.649 3 mmol)与化合物3 (0.174 6 g, 0.649 0 mmol)溶于30 mL乙醇中, 加入0.5 mL哌啶, 80 ℃回流反应6 h。 再经减压蒸馏旋干溶剂, 用二氯甲烷与甲醇溶解, 经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=5:1, V/V)过柱, 最后得到近红色固体粉末0.152 0 g, 收率: 41.87%。 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.66 (s, 2H), 8.54~8.39 (m, 2H), 8.13~8.03 (m, 2H), 7.94 (s, 4H), 7.82 (s, 2H), 7.44 (s, 4H), 7.23 (s, 3H), 5.58 (s, 2H), 2.22 (s, 3H)。 MS: m/z, 理论值: [M-Br]- 479.16; 测量值: 478.95。

2 结果与讨论
2.1 探针(1)对粘度及H2O2响应的机理

探针(1)结构中在吡啶结构单元氮原子上连有体积较大的4-亚甲基苯硼酸基团, 从而促进了整体分子的TICT效应, 因此探针(1)在溶液中不具有荧光发射特性。 而在粘度较大的溶液中, TICT效应能有效被抑制, 且分子内保留了从苯并噻唑单元至正离子吡啶环强烈的ICT效应, 因此探针(1)能呈现出较强的荧光发射, 且发射波长位于较长的近红外波段处(680 nm)。 在有H2O2存在条件下, H2O2能与探针(1)中的苯硼酸识别单元反应使其氧化成酚羟基, 进一步经1, 4-消除反应可脱除亚甲基苯硼酸基团, 得到的产物呈现出强的橙色荧光。 基于上述不同的响应过程, 探针(1)能实现对粘度及H2O2的双波长通道的同时响应(图2)。

图2 探针(1)对粘度及H2O2响应的原理图Fig.2 The response mechanisms of probe (1) for viscosity and H2O2

2.2 探针(1)对粘度荧光响应

首先测试了探针(1)在不同比例丙三醇-DMSO体系中荧光光谱随粘度变化的曲线。 如图3(a)所示, 探针(1)在所考察的波长处几乎无荧光发射。 而随着溶液体系粘度的增高, 探针在680 nm处的荧光逐渐增强, 粘度从1.996 cp(100%DMSO)变化至851.8 cp(10%DMSO, 90%丙三醇), 荧光强度增加了85倍。 且荧光强度的对数与粘度的对数在96.58~568.88 cp范围内呈现出良好的线性关系[图3(b)], 线性方程为log(I680)=1.2132×log(Viscosity)-1.402 3, 相关系数的平方为0.997。

图3 (a) 探针(1)(10 μmol·L-1)在不同比例丙三醇-DMSO溶液体系中(比例依箭头方向依次为: 0:10, 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1)的荧光发射光谱图; 插图为探针在低粘度及高粘度溶液中的荧光照片图, 激发光源为手持式紫外灯(365 nm); (b) 体系荧光强度对数与粘度对数的线性拟合图Fig.3 (a) Fluorescence spectra of probe (1) in DMSO-glycerol solution. Inset: the photographs of probe (1) at low (down) and high (up) viscosity under a 365 nm UV lamp; (b) The fitted curve of log(I680) versus log(Viscosity), λex=450 nm

2.3 探针(1)对H2O2响应的紫外光谱测试

首先考察了探针(1)在磷酸缓冲溶液/DMSO混合溶剂体系(10 mmol·L-1, pH 7.4, 1/1, V/V)中对H2O2的紫外光谱响应。 如图4所示, 探针(1)在375和540 nm处有吸收, 溶液呈紫红色、 红色(图4)。 随着H2O2的加入, 体系在375和540 nm处吸收逐渐减弱, 在460 nm处出现新的吸收峰, 并且随H2O2浓度的增大而逐渐增强, 当H2O2浓度为200 μmol·L-1吸收峰达到最大值, 反应进行完全, 溶液变为黄色。 反应过程中, 紫外光谱的蓝移可归因于探针与H2O2反应后, 脱除了亚甲基苯硼酸基团, N取代吡啶正离子结构随之消失, 从而削弱了分子的ICT效应。

图4 探针(1)(10 μmol·L-1)在不同浓度H2O2(依箭头方向, 浓度依次为: 0, 20, 40, 60, 80, 100, 200和300 μmol·L-1)存在条件下的紫外光谱图; 插图为相应探针溶液(上)及探针与H2O2 (200 μmol·L-1)混合溶液(下)的照片Fig.4 UV-Vis spectra of probe (1) in the presence of different concentrations of H2O2 (0, 20, 40, 60, 80, 100, 200 and 300 μmol·L-1), Inset: the photographs of probe (1) (up) and probe 1 with H2O2 (200 μmol·L-1) (down)

2.4 探针(1)对H2O2检测的灵敏度与选择性

实验在磷酸缓冲与DMSO的混合溶剂体系中(10 mmol·L-1, pH 7.4, 1/1, V/V)考察了探针(1)的荧光响应与H2O2浓度之间的定量关系。 如图5(a, b), 随着H2O2浓度的增加, 探针体系的荧光发射逐渐增强, 当过氧化氢为200 μmol·L-1时, 反应达到平台。 且线性拟合发现体系在590 nm处的荧光发射强度与过氧化氢浓度在0~25 μmol·L-1范围内呈现良好的线性关系, 线性方程为: I590=2.742× cH2O2/μmol·L-1+27.986 (R2=0.996 6), 根据3σ规则计算检出限为0.34 μmol·L-1。

图5 (a)探针与不同浓度的H2O2(依箭头方向, 浓度依次为: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250和300 μmol·L-1)反应后的荧光图谱; (b)对应的探针与不同浓度的H2O2反应后的荧光发射的强度, 插图为荧光强度与H2O2浓度的线性拟合图Fig.5 (a) Fluorescence spectra of probe (1) in the presence of different concentrations of H2O2(from 0 to 300 μmol·L-1); (b) The correlation beween fluorescence intensity of probe (1) with the concentration of H2O2. Inset: the fitted curve of I590 versus the concentration of H2O2

实验考察了探针(1)对H2O2检测的选择性。 实验平行考察了探针(1)对H2O2及其他离子与重要生物分子的荧光光谱响应。 选择的离子包括K+, Na+, Al3+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, Br O3-, C O32-, H2P O4-, N O3-, S2 O32-, S O42-, S2-, Cl O4-, Cl-, 生物分子包括常见的Cys与GSH。 荧光光谱测试结果如图6所示, 仅H2O2使荧光产生了明显增强, 而其他的潜在干扰物均没有引起明显的荧光发射光谱的变化, 说明该探针对H2O2具有良好的选择性。

图6 探针(1)(10 μmol·L-1)与H2O2(200 μmol·L-1)及其他干扰物(200 μmol·L-1)反应后的荧光光谱图Fig.6 Fluorescence spectra of probe (1) (10 μmol·L-1) in the presence of H2O2 (200 μmol·L-1) and other interferences (200 μmol·L-1)

2.5 细胞成像分析

实验用探针(1)进行了活细胞成像分析[见图7(a—f)], 当A549细胞与探针(1)培育后仅显示出了很微弱的荧光[图7(b)]。 而A549细胞先用H2O2处理, 再加入探针(1)培育, 结观察到了强的细胞内荧光[图7(e)], 且细胞保持了较好的存在形态。 上述结果表明, 探针(1)具有较好的生物相容性及细胞膜通透性, 且可有效用于活细胞内的成像分析。

图7 探针(1)的细胞成像照片
(a), (b), (c)为A549细胞与探针(1)培育的照片; (d), (e), (f)为A549细胞与H2O2培养后再与探针(1)培育的照片; (a), (d)为明场照片; (b), (e)为荧光成像照片; (c), (f)分别为(a), (b)及(d), (e)合并的图片; 浓度标尺为20 μmol·L-1Fig.7 Confocal fluorescence images of live A549 cells
Cells incubated with 10 μmol·L-1 probe (1) (a), (b), (c), cells incubated with 100 μmol·L-1 H2O2 and consequently with 10 μmol·L-1 probe (1) (d), (e), (f); (a) and (d) are bright-field images; (b) and (e) are fluorescence images images in red channel; (c) and (f) are merged images; Scale bar: 20 μmol·L-1

3 结论

合成了一种具有D-π -A结构的近红外荧光探针, 探针能实现对粘度及H2O2的双重响应。 其中对粘度响应的荧光发射波长在680 nm处, 线性范围为96.58~568.88 cp。 对H2O2的增强型荧光响应波长在590 nm处, 线性范围为0~25 μmol·L-1, 检出限为0.34 μmol·L-1, 且对H2O2的检测具有良好的选择性。 此外细胞实验表明, 该探针具有良好的生物相容性与细胞膜通透性, 且可有效用于细胞内H2O2的成像分析。

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