胆红素二甲酯与铜离子配合物的激发态光谱特性研究

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闫姝君, 刘阳依, 和晓晓, 郑名, 曹潇丹, 徐建华, 陈缙泉. 胆红素二甲酯与铜离子配合物的激发态光谱特性研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2020,40(6): 1674-1678.
YAN Shu-jun, LIU Yang-yi, HE Xiao-xiao, ZHENG Ming, CAO Xiao-dan, XU Jian-hua, CHEN Jin-quan. Excited State Dynamics of Bilirubin Dimethyl Ester-Copper Ions Complex[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2020,40(6): 1674-1678.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2020)06-1674-05 复制到剪切板

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胆红素二甲酯与铜离子配合物的激发态光谱特性研究

闫姝君, 刘阳依, 和晓晓, 郑名, 曹潇丹, 徐建华, 陈缙泉^*

华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室, 上海 200062

*通讯联系人 e-mail: jqchen@lps.ecnu.edu.cn

作者简介: 闫姝君, 1994年生, 华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室硕士研究生 e-mail: 583520922@qq.com

收稿日期: 2019-03-15

基金: 国家自然科学基金委面上基金项目(11674101, 21873030)资助

摘要

胆红素二甲酯(bilirubin dimethyl ester, BRE)是一种线性四吡咯, 是胆红素 (Bilirubin, BR)的类似物^[1-3]。用UV, IR, MS等光谱表征BR与BRE, 结果并无明显差别。 BR/BRE可与多种金属离子形成配合物。 BR与金属离子的配位点主要是吡咯氮和丙酸侧链, 用甲基取代BR丙酸侧链羧基上的氢得到BRE, 使金属离子只与吡咯氮配位。因此本文采用酯化的胆红素BRE研究其与金属离子的作用, 优点是可以减少与金属的配位点, 降低产物复杂程度, 有助于光谱分析。

关键词: 胆红素二甲酯; 铜离子; 瞬态吸收光谱; 配体金属电荷转移

中图分类号:O657.3 文献标志码:A

Excited State Dynamics of Bilirubin Dimethyl Ester-Copper Ions Complex

YAN Shu-jun, LIU Yang-yi, HE Xiao-xiao, ZHENG Ming, CAO Xiao-dan, XU Jian-hua, CHEN Jin-quan^*

State Key Laboratory of Precision Spectroscopy, East China Normal University, Shanghai 200062, China

*Corresponding author

Abstract

Bilirubin dimethyl ester (BRE) is a linear tetrapyrrole which is an analogue of bilirubin (BR)^[1-3]/ There is no significant difference betweenthe UV, IR and MS spectra of BR and BRE. BR/BRE can form complexes with a variety of metal ions. The coordination sites of BR and metal ions are mainly the pyrrole nitrogen, and propionic acid side chains, and the hydroxyl groups of the BR propionic acid side chains couldbe substituted with methyl groups to obtain BRE so that the metal ions only coordinate with the nitrogen on the pyrrole ring. Therefore, we have used esterified bilirubin BRE to study its interaction with metal ions, which has the advantages of reducing the coordination point with the metal, as well as the complexity of the product, and contributing to the spectral analysis. Metal ions have an effect on the fluorescence characteristics of BR/BRE. Unlike the fluorescence enhancement of Zn²⁺, Cu²⁺ has an obviousfluorescence quenching on BRE. Studies have shown that hyperbilirubinemia and gallstones are related to BR and copper ions^[4-7]. Therefore, studying the interaction of bilirubin and its analogues with Cu²⁺ is of great significance for the prevention and treatment of these diseases. When linear tetrapyrrole molecules coordinate with metal ions, they generally transform from the original chain structure to a porphyrin-like ring structure to suit the coordination with the central ion, a copper ion and the four central pyrrole nitrogens on a BR/BRE molecule coordinate to form a metal-centre square planar structure (Fig.1). BRE itself has a relatively low fluorescence quantum yield because the vibration of the pyrrole ring causes some excited molecules to decay to the ground state in a non-radiative manner^[8]. Coordination of Cu²⁺ with BRE may cause their energy levels to couple to generate a new non-radiative de-excitation pathway leading to a decrease in fluorescence, but further research is needed on the quenching mechanism of Cu²⁺ on BRE fluorescence. The de-excitation processes of the excited state molecules generally occur on the ultra-fast time scale, which cannot be observed by the traditional steady-state spectroscopy. The visible and infrared-band femtosecond transient absorption spectroscopy techniques were used to study the excited state spectral properties of BRE-Cu²⁺ complex in this paper. A new quenching mechanism of Cu²⁺ on the BRE flurescnece was discovered by the transient absorption spectrain the visible and infrared region. We have proposed and confirmed the Ligand-to-metal charge transfer (LMCT) as a result of the fluorescence quenching. Compared with the spectral properties of BRE, the charge transfer state would provide a non-radiative decay pathway to BRE-Cu²⁺ complex, reducing the fluorescence quantum yield of BRE to 5% of its original value. Moreover, two lifetimes (11 ps and 186 ps) were obtained by fitting the kinetic curves of the transient absorption spectra of the complex. We assign the 11 ps component to the build-up process of the LMCT state, while the 186 ps is the lifetime of the charge transfer state.

Keyword: Bilirubin dimethyl ester; Copper ion; Transient absorption spectrum; Ligand-to-metal charge transfer

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引言

金属离子会对BR/BRE的荧光特性产生影响, 不同于Zn²⁺的荧光增强作用, Cu²⁺对BRE有明显的荧光猝灭。研究表明, 高胆红素血症和胆结石等疾病与BR和Cu²⁺有关^{[3, 4, 5]}, 研究胆红素及其类似物与Cu²⁺的相互作用对这些疾病的防治有重要意义。线性四吡咯分子为适应与中心离子的配合, 一般从原来的链式结构转变成类似卟啉的环状结构, 一个Cu²⁺与一个BR/BRE分子的四个中心吡咯氮配位, 形成金属中心的方形平面结构(图1)。 BRE本身荧光量子产率较低, 原因是吡咯环的振动使大部分激发态分子以无辐射方式弛豫回基态^[6]。 BRE与Cu²⁺配位后可能发生能级耦合产生新的非辐射退激发通路导致荧光减弱, 但是有关Cu²⁺对BRE荧光的猝灭机制, 还需进一步的研究。

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	图1 BR, BRE及其与Cu²⁺配合物的分子结构示意图Fig.1 Schematic structures of BR, BRE and Cu²⁺ complex

激发态分子的退激发过程一般发生在超快时间尺度内, 传统稳态光谱技术无法观测。本文采用可见和近红外波段飞秒瞬态吸收光谱技术研究了BRE与Cu²⁺配合物的激发态光谱特性, 不仅对其可见光波段的光谱进行了分析, 还结合红外区域的光谱发现了Cu²⁺对BRE的荧光猝灭机制, 首次提出并证实了荧光猝灭的原因是配体到金属的电荷转移(ligand-to-metal charge transfer, LMCT)。与BRE本身相比, 这个电荷转移态为BRE-Cu²⁺配合物增加了一条非辐射退激发通路, 使其荧光量子产率减小为BRE的~5%。通过拟合配合物激发态光谱的动力学曲线得到两个寿命, 分别为11 ps和186 ps。其中11 ps为LMCT态的建立过程, 186 ps为分子由此中间态弛豫回基态的时间。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

BRE, 百灵威科技有限公司; 无水醋酸铜, 99.99%, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; DMSO, 光谱级, > 99.9%, 上海麦克林生化科技有限公司; 荧光素, 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

紫外-可见分光光度计(TU1901, Beijing Purkinje General Instrument Co.Ltd)用于测紫外可见吸收光谱, 可探测波长范围为190~900 nm, 波长准确度为±0.3 nm。稳态荧光发射光谱数据的采集使用的是Horiba公司生产的FluoroMax-4型荧光光谱仪, 由于不同的波长下光源的功率和探测器的探测效率都有所不同, 所以我们选用S1c/R1c信号作为样品的荧光发射光谱。飞秒瞬态吸收系统的激光器是Coherent公司生产的Astrella, 输出波长为800 nm, 重复频率1 kHz, 单脉冲能量> 7 mJ, 脉冲宽度100 fs; OPA是Coherent公司生产的OperA Solo, 可产生240~2 600 nm内任意波长的光作为激发样品的泵浦光; 光谱仪是Ultrafast System公司生产的Helios-EOS fire, 由激光器产生的800 nm光束经过延迟线后打在氟化钙/蓝宝石晶体上, 产生用于检测的白光脉冲, 延迟线可达到的最长时间窗口为8 ns。

1.2 方法

胆红素是难溶于水的脂溶性物质, 常用溶剂有二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO); 由于羧基的存在, BR也可溶解于碱性溶液中^[7]。 BRE比BR有更强的亲脂性, 考虑到金属离子可能与碱性物质发生反应, 一般选用DMSO作为溶剂。配制BRE, BRE-Cu²⁺溶液(其中BRE和Cu²⁺的浓度比为1:4, 过量的Cu²⁺是为了使BRE与Cu²⁺充分结合), 溶剂为DMSO。用于测紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的BRE溶液浓度为10 μmol·L^-1, BRE-Cu²⁺溶液中BRE浓度固定为10 μmol·L^-1, 改变Cu²⁺的浓度配制不同配比的BRE-Cu²⁺溶液, Cu²⁺浓度分别为10, 40, 100, 200和400 μmol·L^-1; 用于测瞬态吸收光谱的BRE溶液浓度为50 μmol·L^-1, BRE-Cu²⁺溶液中BRE和Cu²⁺浓度分别为50 μmol·L^-1和200 μmol·L^-1, 配好的样品注意避光保存。

紫外-可见分光光度计测量光谱范围设置为300~900 nm, 避免短波长的光损坏样品; 稳态荧光光谱的激发波长430 nm, 狭缝宽度为3/3 mm; 飞秒瞬态吸收光谱系统中选择波长450 nm的脉冲作泵浦光, 功率约为0.15 mW, 探测光波长范围有340~740和750~850 nm两个波段, 测量的时间窗口为500 ps(BRE)和3 ns(BRE-Cu²⁺)。

2 结果与讨论

BRE和Cu²⁺混合后, 生成了稳定的配合物, 如图2为BRE和不同浓度配比的BRE-Cu²⁺在DMSO中的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。 BRE与Cu²⁺浓度比为1:1时光谱发生明显改变, 1:4时已充分结合完全。 BRE吸收峰和发射峰分别位于453和525 nm左右, 可以看出, 与Cu²⁺配位后, 吸收峰蓝移约23 nm, 且在815 nm附近出现了一个新的吸收带。从稳态荧光光谱可以看出, BRE-Cu²⁺的荧光发生了明显猝灭。我们以荧光素作为标准物, 用相对法测定了BRE和BRE-Cu²⁺在DMSO中的荧光量子产率, 发现BRE与Cu²⁺配合之后荧光量子产率降低为原来的5%。

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图2 BRE(浓度为10 μmol·L^-1)与BRE-Cu²⁺配合物(BRE浓度为10 μmol·L^-1; Cu²⁺浓度分别为10, 40, 100, 200, 400 μmol·L^-1)的紫外可见吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)Fig.2 UV-Vis absorption (a) and fluorescence emission spectra (b) of BRE (concentration: 10 μmol·L^-1) and BRE-Cu²⁺ complex (concentration of BRE: 10 μmol·L^-1; concentration of Cu²⁺: 10, 40, 100, 200, 400 μmol·L^-1)

为了探究Cu²⁺使BRE荧光猝灭的机理, 我们用飞秒分辨的激光泵浦-探测技术对BRE-Cu²⁺进行分析。 BRE和BRE-Cu²⁺配合物的瞬态吸收光谱如图3所示。 BRE在380~490 nm范围内显现出明显的基态漂白(ground state bleaching, GSB)^[8]信号。对于峰值位于350 nm附近和490~740 nm的宽谱正信号, 是分子被泵浦到激发态后的激发态吸收(excited state absorption, ESA)。对于350和510 nm附近的ESA信号来说, 在光谱的初期(仪器响应函数IRF≈ 120 fs)就达到信号的最大值, 这说明二者均是BRE分子在接受光激发后所达到的初始激发态。而对于在550~650 nm左右、 0~5 ps内逐渐上升的ESA信号, 我们认为这是BRE分子退激发过程中经历的中间态, 可能是因为BRE分子的扭转形成的。

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	图3 BRE和BRE-Cu²⁺的瞬态吸收光谱Fig.3 Transient absorption spectra of BRE and BRE-Cu²⁺ complex

表1 BRE与BRE-Cu²⁺的吸收、发射峰和荧光量子产率 Table 1 Absorption, emission peak wavelength and fluorescence quantum yield of BRE and BRE-Cu²⁺ complex

当BRE分子与Cu²⁺形成配合物后, 其瞬态吸收光谱信号发生明显变化。峰值为430 nm左右的负信号是典型的GSB信号, 与紫外可见吸收光谱的吸收峰波长一致。峰值在480 nm附近且随时间推移逐渐蓝移(在200 ps时, 峰值处波长约为475 nm)的是ESA信号, 伴随着短寿命的激发态弛豫过程。从整体上看, 500~600 nm之间BRE-Cu²⁺比BRE少了一个ESA峰。选取515和550 nm处的动力学曲线进行对比, 如图4(a), 可以看出, BRE在515和550 nm附近有明显的中间态建立过程, 而且两处上升沿趋势不同。而BRE-Cu²⁺则是直接到达激发态。光物理过程的明显区别说明BRE与Cu²⁺配位之后发生了能级耦合, 我们猜想BRE的荧光猝灭可能是由于配体到金属的电荷转移(ligand-to-metal charge transfer, LMCT)导致辐射跃迁速率变低。

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	图4 BRE和BRE-Cu²⁺在515和550 nm处的动力学曲线Fig.4 Kinetics of BRE and BRE-Cu²⁺ complex at 515 nm, 550 nm

为了验证上述理论, 我们探测了红外区域的瞬态吸收光谱, 如图5所示。由图2的紫外可见吸收光谱知BRE-Cu²⁺在815 nm附近产生了新的吸收带, 而图5显示样品在805~840 nm处有正的ESA信号, 而不是负的GSB信号, 信号强度在十几皮秒时达到了最大, 然后随时间减弱, 说明此处的能态是样品分子被激发后的一定时间内生成的LMCT态, 而不是分子本身的初始激发态。我们对数据进行全局拟合, 得到两个寿命11和186 ps, 如图6为839 nm处的动力学曲线, 可以看出, 这个中间态有一个建立的过程, 因此我们认为11 ps的寿命就是LMCT态, 即被激发的分子存在一个11 ps的配体到金属的电荷转移过程, 然后以186 ps弛豫回基态。因此, Cu²⁺与BRE的配位导致BRE荧光猝灭的原因是发生了配体到金属的电荷转移, 增加了一个激发态的非辐射弛豫通路, 从而减小了辐射跃迁速率。此外, 铜离子对胆红素、胆绿素等线性四吡咯分子的荧光也有猝灭作用, 我们可以推测在这些结构类似的分子中, 也存在吡咯环到铜离子, 即配体到金属的电荷转移, 这个激发态的电荷转移过程使配体分子发生荧光猝灭。

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	图5 BRE-Cu²⁺的红外区域的瞬态吸收光谱Fig.5 Transient absorption spectra of BRE-Cu²⁺ complex in infrared region

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	图6 BRE-Cu²⁺在839 nm处的动力学曲线Fig.6 Kinetic of BRE-Cu²⁺ complex at 839 nm

3 结论

以胆红素二甲酯与铜离子的配合物为研究对象, 用紫外可见分光光度法、稳态荧光发射光谱和飞秒瞬态吸收光谱等技术对其进行了分析。 Cu²⁺对BRE有明显的荧光猝灭作用, 使BRE-Cu²⁺的荧光量子产率降低为BRE的5%。配合物分子在吸收光子到达激发态后会伴随着振动弛豫、内转换、系间窜越、荧光发射以及电荷转移、质子转移等过程, 它们通常发生在超快时间尺度内。瞬态吸收光谱技术是研究在液相中分子超快动力学的一种理想方法。 BRE和BRE-Cu²⁺的瞬态吸收光谱表明, BRE与Cu²⁺发生了能级耦合, 激发态的BRE-Cu²⁺出现了与BRE不同的光物理过程, 荧光猝灭可能是由于配体到金属的电荷转移。然后我们在红外探测的瞬态吸收光谱中看到了LMCT态的信号, 这个中间态有11 ps的建立过程, 然后激发态分子以186 ps弛豫回基态。

参考文献

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