所使用的胶质瘤细胞悬液、 无胸腺裸小鼠和标准H& E染色病理切片均由吉林大学中日联谊医院提供, 其中无胸腺裸小鼠体重15~20 g, 鼠龄5~7周, 饲养于无菌净化室内。 实验经吉林大学中日联谊医院审批, 并符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》要求。

共取8只无胸腺裸小鼠, 建立人脑胶质瘤裸小鼠脑内原位移植动物模型, 分别经20%水合氯醛吸入麻醉后, 俯卧位固定头颅, 酒精消毒皮肤, 在裸小鼠额部距颅中线右侧2.5 mm, 冠状缝前1 mm处先用直径1 mm的牙科钻小心钻穿颅骨, 然后用吸有瘤细胞悬液的微量进样器经孔垂直进入脑实质中, 进针深度为针尖距颅骨表面3.5 mm, 注射前将针稍微回退0.5~1 mm, 缓慢注入, 除针前停留2 min。 接种部位为裸小鼠右侧大脑尾状核。 肿瘤接种后19 d对裸小鼠进行MRI检查, 确认其颅内肿瘤形成。

每次进行高光谱成像数据采集前要采集环境暗噪声和标准漫反射率板的成像光谱数据, 作为高光谱成像数据的校正依据^[9]。 整个数据采集过程保持在室温22 ℃、 恒定暗光照条件进行, 依次对每只脑胶质瘤小鼠进行数据采集。 首先, 将脑胶质瘤小鼠麻醉后, 俯卧位固定于立体定向仪底板上, 在手术显微镜下沿中线剪开约2 cm, 颅骨钻孔形成圆形骨窗, 暴露肿瘤表面。 其次, 调节搭载高光谱成像仪的手术显微镜, 使得肿瘤位于显微镜视野中心, 利用高光谱成像仪采集肿瘤的高光谱成像数据, 每隔1分钟采集一组, 共采集5组数据。 并将数据存储于计算机中。

数据采集完成后, 立即完整取出脑组织及肿瘤组织, 固定于4%多聚甲醛中, 24 h后进行石蜡包埋处理, 之后制作标准H& E染色切片。 利用搭载高光谱成像仪的显微镜进行脑胶质瘤染色病理切片的高光谱成像数据采集, 并将数据存储于计算机中。

光源辐射能量穿透样本或在样本表面反射后形成样本的特征光谱, 并为高光谱成像仪所记录, 对该特征光谱进行分析以寻找正常组织与肿瘤组织的光谱差异并以此实现二者之间的区分。 为降低噪声影响, 使光谱特征差异显著化以便于区分, 需要对所获取的光谱信息进行一定的数据处理。

2.4.1 非均匀性校正

对于本研究使用的高光谱成像仪, 探测器平面的每一行都有一定数量的探测单元, 对应一个波段, 随着推扫运动以行为单位获取成像光谱数据。 对于一个波段来说, 探测单元之间存在响应不一致的问题, 进而产生严重的条带噪声, 即图像列之间的不均匀, 影响成像光谱数据的后续处理和应用。 不同探测单元的响应函数会随着入射强度变化而不同, 因而导致条带噪声。 需要对数据进行非均匀性校正, 方法如下:

逐波段对原始成像光谱数据进行标准矩匹配校正, 得到标准矩匹配校正图像。 计算方法为

D'i, j=σrσiDi, j+μr-σrσiμl, 1≤i≤M, 1≤j≤N, i, j∈Z(1)

其中, D'_{i, j}为矩匹配校正后像元值; D_{i, j}为原始像元值; i和j分别为列和行号; M和N分别为列数和行数; μ _i和μ _r分别为第i列和参考列的均值; σ _i和σ _r分别为第i列和参考列的标准方差。

以标准矩匹配校正图像为基础, 选择相邻两列像元中相同像元, 对于某一波段来说, 选择方法为

Φi={j|abs(D'i, j-D'i-1, j)≤T, 2≤i≤M, 1≤j≤N, i, j∈Z}(2)

其中, Φ _i为所选择相邻两列像元中相同像元集; D'_{i, j} , D'_{i-1, j}为标准矩匹配校正像元值; T为阈值; abs()为取绝对值。

对于相邻两列原始数据, 以前一列为基准, 用两列中相同像元, 通过线性回归得到后一列的校正系数, 计算方法为

{Ai, Bi}=regress(Di, j, Di-1, j), j∈Φ(3)

其中, A_i和B_i为校正系数; regress(· , · )为线性回归。 根据校正系数对后一列进行校正, 顺次遍历一个波段的所有列, 完成一个波段图像非均匀性校正。 计算方法为

D^i, j=AiDi, j+Bi(4)

其中, D^i, j为校正后像元值; D_{i, j}为原始像元值。 按照此流程, 遍历一幅成像光谱数据的所有波段, 完成成像光谱数据的非均匀性校正。

2.4.2 光谱去噪

对于高光谱成像数据而言, 去噪需要尽可能保证光谱的形状。 SG滤波器是一种在时域内基于滑动滤波窗口多项式拟合的滤波方法, 具有计算量小, 计算速度快, 可以很好地保持波形的相对极大值、 极小值和脉冲宽度等特性, 比较适用于光谱去噪。 SG滤波过程如下:

确定滤波窗口和多项式次数。 根据高光谱成像仪的采样特点确定成像光谱数据滤波窗口大小及变化范围, 多项式次数及其变化范围。

用最小二乘法对原始成像光谱数据进行滑动拟合, 并求出卷积系数。 用卷积系数对原始成像光谱数据进行卷积计算, 完成SG滤波, 得到去噪后的成像光谱数据。 在2M+1成像光谱数据滤波窗口内, 可以用多项式来拟合波形数据, 多项式表达为

p(n)=∑k=0raknk(5)

其中, p(n)为多项式; n为2M+1成像光谱数据滤波窗口内波形数据点的位置, -M≤ n≤ M; k为多项式次数; a_k为多项式系数。 最小二乘法求出系数a_k就可计算拟合后的成像光谱数据滤波窗口内某点的拟合数值, 该数值作为去噪后的数值。 按照上述方式, 遍历显微成像光谱数据所有像元。 窗口选择与仪器噪声水平有很大关系, 需要结合数据噪声大小进行调整, 噪声越大窗口越大。 因此, 对于特定仪器窗口相对较稳定, 所选择的去噪窗口大小5。 处理效果如图2所示。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 光谱去噪处理 (a): 常规方法去噪处理结果; (b): SG滤波法去噪处理结果Fig.2 Spectral denoising (a): Noise removal by conventional method; (b): Noise removal by SG filtering method

2.4.3 极差标准化处理

无论是反射光谱, 还是透射光谱, 其特征主要反映在光谱曲线的形状上。 形状的差异更有利于区分不同物质的特征光谱。 对光谱信息进行极差标准化处理, 可以更加直观地反映光谱曲线的形状特征。 光谱极差标准化的计算公式为

SN(λ)=S(λ)-Smin(λ)Smax(λ)-Smin(λ)(6)

其中, S(λ )为样本的反射率或透射率; S_min(λ )为光谱的最小值; S_max(λ )为光谱的最大值。 极差标准化处理可以有效减弱因光照、 暗电流偏移等因素造成的光谱信息系统性误差。 极差标准化处理效果如图3所示。

图3

Fig.3

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	图3 极差标准化处理 (a): 极差标准化处理前; (b): 极差标准化处理后Fig.3 Range standardization (a): Before range standardization; (b): After range standardization