Nano-ZS-90马尔文激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司); Spectrum Two傅里叶变换近红外光谱仪和LAMBDA 365紫外光谱(美国珀金埃尔默股份有限公司); F-7000荧光光谱仪(日本日立仪器(上海)有限公司); ALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥机(德国Christ); Chirascan qCD(英国应用光物理公司)。

汉麻籽仁(广西巴马: 蛋白31.11%± 1.15%、 脂肪53.05%± 2.32%); 大豆分离蛋白(实验室自制, 蛋白92.64%± 1.34%, 脂肪0.4%± 0.12%); 硼酸、 硫酸铜、 磷酸氢二钠, 磷酸二氢钠等均为国产分析纯。

汉麻籽仁先用正己烷以1:4(w/v)脱脂4 h, 后在通风橱烘干(40 ℃)。 称取一定量的脱脂汉麻籽饼粕(蛋白57.93%± 1.32%), 与去离子水以按1:15(w/v)料液比混合, 用1 mol· L^-1 NaOH调节料液至pH 8.5, 震荡(200 r· min^-1、 60 min、 25 ℃)碱提1 h, 离心(10 000 r· min^-1, 20 min), 上清液用1 mol· L^-1 HCl调节至pH 4.7, 静置30 min后, 离心(10 000 r· min^-1、 20 min), 得到汉麻籽蛋白凝乳, 调节汉麻籽蛋白凝乳pH值为7.0, 冷冻干燥得到汉麻分离蛋白(蛋白含量90.54%± 1.45%, 脂肪含量1.4%± 0.32%)备用。

如图1, 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可知HPI主要为分子量为37 kDa(2号条带)和21 kDa(3号条带)由酸性亚基和碱性亚基组成的麻仁球蛋白; 光密度分析结果显示HPI中麻仁球蛋白组分占HPI 76.41%, 白蛋白占23.59%左右。 此外, 51 kDa和12 kDa左右有一条明显的条带(1和4号条带), 可能与HPI中白蛋白成分相对应, 此结论与Tang等人研究结论相一致^[13]。

图1

Fig.1

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	图1 HPI电泳图Fig.1 SDS-PAGE of HPI

将HPI用0.05 mol· L^-1 不同pH(3.0~10.0)的磷酸盐缓冲溶液配制成2 mg· mL^-1蛋白溶液, 溶解过夜后备用。

HPI和SPI巯基含量的测定参考Beveridge^[9]改进的Ellman试剂法。

采用马尔文激光粒度仪测定样品的流体动力学粒径及其分布。 将蛋白样品用 pH 7.2的磷酸盐缓冲液配制成1 mg· mL^-1的蛋白溶液, 过0.45 μ m水系醋酸纤维素滤膜。 测定温度为25 ℃、 平衡时间为120 s、 分散相折射率为1.471和分散剂折射率为1.330条件下测定3次取平均值。 将蛋白样品用DTS1060C皿在Malvern Zeta Plus测定电位。

将样品用磷酸盐缓冲液(pH 7.2, 0.01 mol· L^-1)稀释成浓度为0.2 mg· mL^-1, 采用Chirascan qCD圆二色光谱仪在波长范围为190~260 nm内扫描三次取平均值, 光径10 mm, 扫描频率为90 nm· min^-1, 间隔时间0.25 s, 以相应磷酸盐缓冲液为溶剂空白。

将冻干的蛋白样品置于干燥器内, 充分干燥, 精确称取2 mg干燥的蛋白样品, 加入200 mg的KBr, 研磨混合均匀, 然后进行压片, 样品红外光谱扫描, 扫描波段 4 000~400 cm^-1, 分辨率4 cm^-1, 扫描次数32。 采集的红外图谱进行基线校正和平滑处理后, 使用Peakfit 4.0.2结合Origin 2017对蛋白酰胺Ⅰ 带(1 700~1 600 cm^-1)做二阶导数、 去卷积和高斯曲线拟合, 根据峰面积计算各种二级结构的相对百分含量。

采用F-7000荧光光谱仪测定蛋白样品荧光光谱, 将样品液用pH 7.2的盐酸缓冲溶液(PBS)稀释为浓度为0.1 mg· mL^-1, 在激发和发射狭缝均为5 nm、 电压为500 V条件下, 以激发波长295 nm, 从300~400 nm波长范围扫描得到荧光光谱, 扫描3次取平均值最后得到内源荧光光谱。

外源荧光采用1-苯胺基-8-萘磺酸荧光探针(ANS)法测定疏水性, 用pH 7.2磷酸盐缓冲液配制2 mg· mL^-1的蛋白样品溶液, 并稀释成0.02, 0.04, 0.06, 0.08和1 g· mL^-1的蛋白样品溶液; 测试前, 取2 mL样品液加入20 μ L 8 mmol· L^-1 ANS, 摇匀静置3 min; 在狭缝为5 nm、 激发波长330 nm、 发射波长490 nm测定样品荧光强度(FI); 试剂做空白。 以相对荧光强度对蛋白浓度作图, 曲线初始阶段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数(H₀)。

称取一定量的蛋白样品, 溶于10 mmol· L^-1磷酸缓冲液(pH 7.2)中, 配置成浓度为0.5 mg· mL^-1的溶液, 磁力搅拌后于25 ℃离心(10 000 r· min^-1, 10 min), 上清液用于紫外光谱分析。 波长范围为190~800 nm, 分辨率为0.2 nm, 扫描速率为60 nm· min^-1。 所得的紫外光谱经origin软件微分化得到紫外光谱二级导数光谱[图4(b)]。

图4

Fig.4

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	图4 HPI和SPI内源荧光(a)和紫外光图谱插图为其二阶导数谱(b)Fig.4 Intrinsic fluorescence (a) and Ultraviolet spectrum (b). The illustration is ultravidet second derivative spectrum of HPI and SPI

在pH 7时, 汉麻蛋白(HPI)游离巯基和二硫键含量如表1所示, 与SPI相比, HPI的游离巯基、 二硫键和总巯基含量均显著(p< 0.01)高于大豆分离蛋白(SPI)中游离巯基、 二硫键和总巯基含量, 分别为10.06, 12.14和32.26 μ mol· g^-1。 HPI中麻仁球蛋白含量约为65%, 而SPI中大豆球蛋白含量约为50%~60%, 即HPI中11S球蛋白含量比SPI中11S球蛋白含量高, 11S球蛋白是由碱性亚基和酸性亚基通过二硫键维持的六聚体, 因而由此也可以推测出HPI中二硫键含量高于SPI中二硫键的含量。 此外, HPI的游离巯基/总巯基比值显著(p< 0.05)小于SPI中游离巯基/总巯基比值, 表明HPI三级结构紧凑程度高于SPI的三级结构。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 HPI和SPI中游离巯基、 总巯基和二硫键含量及游离巯基/总巯基比值 Table 1 Free sulfydryl tatol sulfydryl and disulfide bond content in HPI and SPI, as well as the value of Free sulfydryl/tatol sulfydryl Protein Free sulfydryl /(μ mol· g-1) Total free sulfydryl /(μ mol· g-1) Disulfide bond /(μ mol· g-1) Free sulfydryl/ Total free sulfydryl HPI 12.14± 0.56a 32.26± 1.45a 10.06± 0.34a 0.38b SPI 4.21± 0.25b 9.51± 0.45b 2.66± 0.11b 0.44a 注: a, b表示差异显著(p< 0.05)

表1 HPI和SPI中游离巯基、 总巯基和二硫键含量及游离巯基/总巯基比值 Table 1 Free sulfydryl tatol sulfydryl and disulfide bond content in HPI and SPI, as well as the value of Free sulfydryl/tatol sulfydryl

在25 ℃、 pH 7.2 条件下HPI和SPI粒径分布如图2(a)所示, HPI和SPI粒子数量主要分布范围集中在10 nm左右, 该部分粒子主要为HPI和SPI的天然态, 与文献[9, 10]报道SPI中11S球蛋白(9.5 nm× 9.5 nm× 4.0 nm)和7S球蛋白(9.6 nm× 9.6 nm× 4.4 nm)的大小基本一致; 由此推测, HPI中白蛋白和麻仁球蛋白的粒子大小约为10 nm左右, 由于HPI三级结构比SPI紧凑(表1), 导致HPI粒子大小相比SPI小一些。 还有一部分粒径分布在100~1000 nm范围内的粒子, 这主要是天然态HPI交联形成的可溶性聚集体或者微小杂质造成的; 由此得到的HPI平均粒径为167.4 nm, SPI平均粒径为83.5 nm, HPI平均粒径大于SPI, 可能是因为HPI具有较大的表面疏水性(HPI: 374, SPI: 173), HPI之间通过疏水相互作用形成较大的聚集体。

图2

Fig.2

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	图2 HPI和SPI的粒径(a)和表面电位(b)曲线Fig.2 Size (a) and zeta-potential profiles (b) of HPI and SPI

HPI和SPI表面电荷曲线分布如图2(b)所示, 在pH从10到2过程中, HPI和SPI的表面电荷由负值变成正值, 也即蛋白质分子逐渐质子化过程; 且SPI的表面电荷变化程度大于HPI, SPI等电点(4.51)比HPI等电点(4.65)小, 这个差异主要是由于SPI中酸性氨基酸含量大于HPI, 这些氨基酸使得SPI具有酸性特征。 而本研究中HPI等电点(4.7)比现有文献记载(pI=5)略低, 可能是由蛋白品种差异造成^[4]。

2.3.1 二级结构分析

HPI和SPI二级结构表征如图3所示, 由图3(a)可知, 与SPI相比, HPI在208和222 nm处有显著的负吸收双峰, 表明HPI二级构象中α -螺旋含量高于SPI; HPI和SPI在195 nm处具有显著正吸收峰, 表明HPI和SPI均含有β -折叠结构^[11]。 经dichroweb拟合得出HPI和SPI二级结构分别为: α -螺旋39.1%和11.7%、 β -折叠13.1%和34.4%、 β -转角21.9%和22.9%、 无规则卷曲25.9%和31.9%。 此外, HPI的摩尔椭圆率大于SPI, 也证实了HPI具有紧密的结构特征^[2]。

图3

Fig.3

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	图3 HPI和SPI的圆二色谱图(a)、 傅里叶红外光谱(b)及其酰胺Ⅰ 带分峰拟合结果(c: HPI, d: SPI)图Fig.3 Circular dichroism (a), FTIR (b) and curve-fitting results of amide I band (c: HPI, d: SPI) of HPI and SPI

由图3(b)可知, HPI和SPI均在2 800 cm^-1附近有— NH和— OH的伸缩振动峰; 在3 010~2 700 cm^-1范围内有烷烃或烯烃类(脂肪)的碳碳键或氢键伸缩振动峰, 在1 744 cm^-1附近具有脂基C=O键典型的伸缩振动峰^[12], 其中HPI吸收峰强度远大于SPI, 表明HPI中油脂残留含量高于SPI, 这与原料信息结果一致。 在1 650~1 500 cm^-1范围内的吸收峰是蛋白质典型的肽键(O=C— N— H)振动峰。 在1 150~1 000 cm^-1范围内吸收峰是由碳水化合物引起的, 1 237 cm^-1处的吸收峰则是由C— O或O— H弯曲振动产生的^[12]; 由HPI的FTIR图谱可知HPI中结合油脂含量较高。 由图3(c)和(d)可知, HPI和SPI酰胺Ⅰ 带经peakfit分峰拟合后得到的二级结构含量基本与CD得到的二级结构含量一致, HPI含有较多的α -螺旋结构, 而SPI含有较多的β -折叠。

2.3.2 三级构象分析

由图4(a)可知, HPI和SPI均在330~340 nm附近具有典型的色氨酸残基最大荧光吸收峰, 与SPI相比(λ _max 336.9), HPI最大吸收波长为λ _max 334.4, 说明HPI的亲水性比SPI要差, 也即HPI结构更紧凑, 这与现有文献记载HPI溶解性低于SPI的结果相符^[13]。 与SPI相比, 在300~310 nm处, HPI出现一个小的吸收峰, 可能是为HPI中酪氨酸高于SPI, 因而暴露于亲水环境的酪氨酸比SPI更多, 导致吸收峰比SPI更明显^[6], 此外, 该处的吸收峰还可能有苯丙氨酸残基的荧光贡献。 而SPI最大荧光吸收比HPI要强, 可能是因为HPI结构紧密, 导致芳香族氨基酸残基暴露的程度比SPI差。

同理, 由图4(b)可知, HPI和SPI在190~400 nm范围内出现两个蛋白特征吸收峰在200~230和260~280 nm; 在260~280 nm处HPI吸收峰强度比SPI弱, 也说明HPI暴露的芳香族氨基酸残基含量较少, 具有紧凑的三级结构特征。 这两个特征吸收峰是由芳香族氨基酸残基π → π ^* 跃迁产生, 常规紫外光谱难以分辨酪氨酸、 色氨酸和苯丙氨酸残基对局部微环境影响的贡献, 而二阶导数光谱能很好得分辨以上三个发色基团的贡献率; 由HPI紫外二阶导数光谱可知, HPI和SPI在280~300 nm内有两个正吸收峰, 分别为288, 294 nm和289, 296 nm, 两个负吸收峰285, 289 nm和285, 291 nm; 与SPI相比, HPI发生蓝移, 这与内源荧光结果一致。 此外, 两正负吸收峰距离的比例(r=a/b)可用来推测酪氨酸对构象变化的影响, r值越大, 蛋白结构伸展程度越大, 由图4(b)得到的r_HPI和r_SPI分别为0.441和0.589, 即SPI伸展程度大于HPI。

基于以上得出的HPI结构信息, 为改善HPI溶解特性等功能特性, 探究不同pH条件对HPI构象的影响。

图5可知, 在pH 7→ 3过程中荧光强度先下降后增大, 并伴随着红移; 当pH 7→ 10时, 荧光强度先增大后降低, 伴随着蓝移。 HPI中含有Phe, Tyr和Trp 3个发色基团, 且能量转移由Phe到Tyr和Trp是非常有效的, 因而含有这些基团的蛋白质的吸收性质并不是这些基团的简单加和, 通常认为当发射波长大于290 nm时, 可认为荧光都来自Trp残基^[14]。 在pH 3.0时, 大部分Trp暴露在亲水环境中, 且红移至335.4 nm, 表明此时HPI结构比较松散^[2]。 在pH 6.0时, 荧光强度下降, 最大发射波长发生微小红移至334.6 nm, 表明pH 6.0条件下, 酸诱导HPI蛋白分子展开, 降低了Phe到Tyr和Trp的能量传递效率, 使得Trp的荧光强度下降^[14]。 在pH 8.0时, 荧光强度增强, 表明蛋白分子结构发生了重排, Trp和Trp的相互作用增强, 同时蛋白分子表面的芳香族氨基酸由表面转移至疏水核心, 从而导致荧光强度增大^{[2, 6]}。 而在pH 10.0时, HPI荧光强度显著下降, 最大吸收峰波长微小蓝移, 表面Trp微环境变得更疏水, 荧光强度显著下降可能归因于: (1)解离的Tyr残基荧光消失, 且Trp残基的荧光可能被阴离子状态的Tyr残基猝灭; (2)溶剂猝灭效应; (3)也可能是Lys和Arg残基的正电荷被中和^{[2, 14]}。 本试验在高pH值条件下荧光峰出现蓝移, 在低pH条件下荧光峰出现红移, 并暴露出更多芳香族氨基酸残基于亲水环境中, 与藜麦蛋白质分离^[14]和麻仁球蛋白的行为类似^[6]。

图5

Fig.5

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	图5 不同pH条件对HPI内源荧光吸收的影响Fig.5 Effects of different pH on the intrinsic fluorescence of HPI

由图6可知, pH值由7.0到3.0时, 紫外吸收强度先减小后增大, 在250, 270和285 nm附近出现新的吸收峰, 并伴随着红移, 且290 nm以后的吸收峰逐渐削弱; 该变化趋势与荧光光谱反映出的现象基本一致。 在pH 3.0时, 紫外二阶导数光谱峰信号和峰型与pH 7.0现象相比变化显著, 峰吸收强度增大, 且发生红移, 表明低pH条件下HPI结构得到适当舒展, Phe和Tyr残基的微环境变得更亲水, 在270 nm出现的峰是Tyr残基特征峰, 可能与Tyr上的酚羟基电离后酚氧原子与苯环的大π 键的共轭效应有关; 在250 nm附近出现新的峰是Phe的特征峰, 这可能是由于Phe残基之间的相互作用被减弱, 同时Tyr残基的吸收红移, 使得原本被掩盖的Phe残基特征峰显露出来。 由此推测酸诱导HPI变性时, HPI分子结构得到适当舒展, 使得更多疏水性氨基酸残基暴露于微环境中。

图6

Fig.6

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	图6 不同pH条件对HPI紫外吸收的影响Fig.6 Effects of different pH on the ultraviolet spectrum of HPI

在pH由7.0到10.0时, 紫外二阶导数光谱峰型也发生显著变化, 紫外吸收增强且伴随着蓝移, 而研究认为在三种发色氨基酸中, Phe是疏水性最强的, pH变化基本不会引起其电离度和质子化的变化; 引起这一变化主要可能是强碱条件下蛋白结构打开, Phe残基之间的相互作用减弱, 导致π → π ^* 能极差下降, 由此推测碱性条件下含有Phe残基的侧链柔性增强。

由图7可知, 在不同pH条件下, HPI粒径与天然态(pH 7.0)相比均增大, 天然态的HPI主要以单体形式存在[图2(a)], 在pH降低过程中, HPI粒径不断增大, pH 6.0时有最大平均粒径, 这是因为pH 6.0条件最靠近等电点, HPI表面电荷绝对值较低, 分子之间的排斥力减弱, 容易发生聚集形成大的聚集体。 pH 3.0条件下HPI粒径增大是因为强酸条件蛋白结构变得松散, 肽链展开(图5和图6), 且蛋白表面正电势增大, 分子间的排斥力增大, 抑制了分子之间的聚集, 但一定程度上促进了线性多聚体的产生, 从而提高蛋白溶解度^[15]。 在pH增大过程中, 蛋白粒径逐渐增大; pH 8.0时, 粒径主要分布在10~11和50~60 nm范围, 保持了大部分单体。 在pH 10.0时, 粒径进一步增大, 可能是因为蛋白结构舒展后, 形成更多的单体分子形成线性聚集体。

图7

Fig.7

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	图7 不同pH条件对HPI粒径的影响Fig.7 Effects of different pH on the size of HPI

由图5— 图7可知, 在强酸强碱条件下, 能使HPI分子结构得到适当伸展, 粒径变大, 使得芳香族氨基酸残基之间的距离增大, 降低了Phe到Tyr和Trp的能量传递效率, 最终导致Try残基荧光强度减弱, Phe和Tyr残基的荧光部分被显示, 表明在强酸强碱pH条件下HPI溶解度得到改善。 从荧光光谱和紫外光谱的变化趋势可知, 在酸性条件下HPI的构象稳定性相对较差, 蛋白亚基容易发生解离缔合反应; 而在碱性条件下, HPI构象则相对稳定, 且HPI构象具有更大柔性, 这与大豆硒蛋白的构象类似^[15]。 因此借助荧光光谱和紫外二阶导数光谱, 可以推测HPI氨基酸残基微环境的变化, 从而了解蛋白质分子三维结构的变化信息。