本次实验选择三种比较常见的绿色植物作为研究对象, 分别为吊兰、 绿萝、 金边虎皮兰, 采样地点为东北师范大学校园。 使用尼康相机拍摄其叶片内部结构, 图1(a, b和c)依次为它们的叶片内部结构。 它们的叶片结构差异较大, 随机选取50片处于成熟期阶段的活体叶片作为样品叶片, 并做上标记。 所有实验的测量, 需在暗室条件下进行, 且在实验期间每天以固定时间浇灌相同的水量, 接受相同的光照时间, 以减少叶片本身各物质含量的变化。

图1

Fig.1

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	图1 吊兰(a)、 绿萝(b)、 金边虎皮兰(c)叶片内部结构Fig.1 Internal structure of leaves of Chlorophytum comosum (a), Epipremnum aureum (b), and Sansevieria trifasciata (c)

实验光谱测量平台是一个大型的室内多角度荧光观测平台(MFOP)(图2)。 本实验中, 光纤探测器探测范围为0° ~60° , 间隔为20° 。 光源与光纤探测器之间的探测范围为0° ~360° , 间隔为45° 。 该设备还配备了偏振镜头, 可以通过观测荧光光谱计算荧光偏振度。 利用AvaSpec-ULS2048仪器进行荧光光谱的采集, 其在200~1 100 nm为稳态光谱区间。 使用AvaSoft 8.9软件进行光谱处理, 数据传输速率为每100 ms刷新一次。 激光装置作为激发叶绿素荧光的光源, 该器件由中国长春新工业光电技术有限公司生产, 其入射角设置为58.5° , 激发波长为360 nm。 3种植物活体样品的叶片固定在平台的黑色载体上, 测定了不同观测天顶角(VZA)、 相对方位角(RAA)、 波段、 偏振等相应的荧光光谱。 为了提高信噪比, 避免激光能量波动对荧光强度的影响, 对每个样品的荧光光谱重复测量5次。 分析前, 分别对这些荧光光谱进行平滑处理。

图2

Fig.2

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	图2 多角度荧光观测平台Fig.2 Multi-angle fluorescence observation platform

激发光照射到植物表面, 激发植物内部光系统产生叶绿素荧光信号, 被光谱仪接收。 荧光偏振信息利用斯托克斯参量(I, U, Q, V)获取, 使用荧光偏振度P表示, 测量时忽略圆偏振V^[12]。

I=(I0°+I90°+I45°+I135°)2(1)

U=I45°-I135°(2)

Q=I0°-I90°(3)

P=U2+Q2I(4)

式中: I_0° , I_90° , I_45° 和I_135° 分别表示理想偏振片在0 ° , 45° , 90° 和135° 方向上的荧光偏振光强。

2.1.1 激光诱导叶绿素荧光强度的多角度空间分布

本实验是在暗室条件下进行, 测量三种植物(吊兰、 绿萝、 金边虎皮兰)激光诱导叶绿素荧光的多角度光谱。 图3为三种植物在观测天顶角和相对方位角均为0° (即垂直状态)的条件下测量得到的荧光强度光谱曲线。 不同植被的荧光光谱形状各不相同。 根据过去的研究结果可知, 在室温下绿色植物的LIF光谱通常在680~690 nm处有一个明显的荧光峰, 在730~740 nm处有一个荧光峰^{[13, 14, 15]}。 从图3中可以明显看出, 有两个明显的峰值, 分别对应的波段为685与740 nm, 这与文献[15]结论中的波段范围基本符合。 因此本实验中确定685与740 nm两个峰值作为这三种植物的荧光光谱特征点。

图3

Fig.3

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	图3 三种植物的激光诱导叶绿素荧光光谱曲线Fig.3 Laser-induced chlorophyll fluorescence spectra of three plants

在2π 空间中, 通过不同观测天顶角与相对方位角进行多角度荧光光谱的测量, 二者对荧光强度有不同的影响。 图4为三种植物在相对方位角为90° 时, 观测天顶角变化而引起荧光强度曲线的变化图。 三种植物荧光强度各不相同, 其荧光强度皆随着观测天顶角的增大而减小, 且角度越大, 荧光强度降低的速率越快。

图4

Fig.4

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	图4 在0° , 20° , 40° and 60 ° 的观测天顶角(VZA)下三种植物的荧光强度变化 (a): 吊兰; (b): 绿萝; (c): 金边虎皮兰Fig.4 Fluorescence intensity changes of three plants at 0° , 20° , 40° and 60 ° Viewing Zenith Angles (VZA) (a): Chlorophytum comosum; (b): Epipremnum aureum; (c): Sansevieria trifasciata

图5为三种植物在观测天顶角为40° 时, 不同波段的相对方位角变化而引起的荧光强度变化图。 根据图5可知, 相对方位角不同, 荧光强度各不相同。 在685和740 nm波段上金边虎皮兰的荧光强度波动幅度最大, 吊兰波动幅度最小。

图5

Fig.5

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	图5 三种植物在不同相对方位角(RAA)下685 nm (a)和740 nm (b)两波段的荧光强度变化Fig.5 Fluorescence intensity change of three plants at different Relative Azimuth Angles (RAA) in the 685 nm (a) and 740 nm (b) band

综上所述, 本文结合不同观测天顶角与相对方位角, 以极坐标的方式对激光诱导叶绿素荧光强度的多角度光谱空间分布进行绘制, 如图6所示。 从中可以清晰地看出, 三种植被在2π 空间内685与740 nm两个波段的荧光强度整体分布变化与上文论述一致。

图6

Fig.6

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	图6 三种植物分别在685 nm波段与740 nm波段的多角度光谱空间分布 (a, b): 吊兰; (c, d): 绿萝; (e, f): 金边虎皮兰Fig.6 Multi-angle spectral spatial distribution of the three plants in the bands of 685 nm and 740 nm (a, b): Chlorophytum comosum; (c, d): Epipremnum aureum; (e, f): Sansevieria trifasciata

2.1.2 激光诱导叶绿素荧光强度比值的多角度空间分布以及模型建立

在本研究中, 三种植物在不同相对方位角条件下激发的F₆₈₅/F₇₄₀值与观测天顶角的回归直线如图7所示。 其中运用的方法为荧光强度比值法^[16], 目前大多数研究者将其运用到水分等胁迫实验中, 而本实验将其应用到探究角度因素对荧光强度影响的实验中。 根据图7可知, 三种植物F₆₈₅/F₇₄₀比值的总体趋势基本一致。 在相对方位角为0° 时, 随着观测天顶角的增大, 其比值随之增大; 而在其他相对方位角时, 随着观测天顶角的增大, 其比值随之减小。 由此可知, F₆₈₅/F₇₄₀值与观测天顶角之间具有良好的相关关系。

图7

Fig.7

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	图7 在不同相对方位角下, 三种植物(a, b, c)F685/F740比值随观测天顶角的变化Fig.7 At different Relative Azimuth Angles, the fluorescence ratio of F685/F740 of the three plants (a, b, c) varied with the Viewing Zenith Angles

上文中论述了F₆₈₅/F₇₄₀值与观测天顶角具有良好的相关关系, 因此均可以建立良好线性回归模型, A为观测天顶角度数

F685F740=a×A+b(5)

如表1所示, 共计24个线性回归模型, 仅将模型的R²与RMSE列出。 表1显示, 三种植被在不同相对方位角的条件下, 模型中回归系数较显著, 模型可靠性良好, 能够准确的反映F₆₈₅/F₇₄₀值与观测天顶角之间的关系。 然而, 植被不同, 最合适的模型所对应的相对方位角也不相同。 在相对方位角为270° 时, 植被吊兰的数学回归模型的R²最高, RMSE最小, 模型效果最显著, 225° 次之; 在相对方位角为225° 时, 绿萝与金边虎皮兰的数学回归模型的R²最高, RMSE最小, 模型效果最显著。 综合来看, 相对方位角为225° 是同时研究这三种植被F₆₈₅/F₇₄₀值与观测天顶角关系的最佳方位角。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同相对方位角F685/F740与观测天顶角的线性回归模型相应的R2和RMSE Table 1 The corresponding R2 and RMSE of the Linear regression model of F685/F740 and Viewing Zenith Angles(VZA) at different Relative Azimuth Angles (RAA) 相对方位 角(RAA) 吊兰 绿萝 金边虎皮兰 R2 RMSE R2 RMSE R2 RMSE RAA=0° 0.861 0.017 81 0.731 0.032 28 0.955 0.040 51 RAA=45° 0.734 0.034 43 0.002 0.027 13 0.131 0.052 85 RAA=90° 0.832 0.748 00 0.763 0.035 40 0.948 0.004 68 RAA=135° 0.162 0.031 32 0.984 0.012 33 0.849 0.007 90 RAA=180° 0.682 0.523 0.899 0.025 13 0.922 0.014 67 RAA=225° 0.892 0.032 21 0.978 0.011 01 0.991 0.004 66 RAA=270° 0.908 0.014 82 0.121 0.023 82 0.835 0.036 21 RAA=315° 0.469 0.163 21 0.277 0.071 11 0.065 0.043 05

表1 不同相对方位角F685/F740与观测天顶角的线性回归模型相应的R2和RMSE Table 1 The corresponding R2 and RMSE of the Linear regression model of F685/F740 and Viewing Zenith Angles(VZA) at different Relative Azimuth Angles (RAA)

在本实验中, 激光诱导叶绿素荧光偏振信息是用荧光偏振度表示。 图8为三种植物在两个波段上荧光偏振度的相关分析图, 表明二者有很强的相关关系。 因此, 建立良好线性回归模型, D_F685表示在685 nm波段的荧光偏振度, D_F740表示在740 nm波段的荧光偏振度

DF740=a×DF685+b(6)

图8

Fig.8

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	图8 三种植物在685和740 nm波段上的Dop值相关分析 (a): 吊兰; (b): 绿萝; (c): 金边虎皮兰Fig.8 Dop value correlation analysis of three plants on the 685 and 740 nm bands (a): Chlorophytum comosum; (b): Epipremnum aureum; (c): Sansevieria trifasciata

三种植物在波段685与740 nm之间荧光偏振度的R²分别是0.945, 0.412和0.809, RMSE分别为0.008 66, 0.024 84和0.016 11, 如表2所示。 说明模型的回归系数较显著, 模型可靠性良好, 再次反映在685与740 nm波段上二者荧光偏振度具有较好的相关性。 因此下面对每种植物两个波段荧光偏振度的多角度空间分布进行对比分析与探究。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 F685/F740与观测天顶角的线性回归模型相应的R2和RMSE Table 2 The corresponding R2 and RMSE of the Linear regression model of F685/F740 and Viewing Zenith Angles(VZA) 植被类型 评价标准 R2 RMSE 吊兰 0.947 0.008 66 绿萝 0.453 0.024 84 金边虎皮兰 0.933 0.016 11

表2 F685/F740与观测天顶角的线性回归模型相应的R2和RMSE Table 2 The corresponding R2 and RMSE of the Linear regression model of F685/F740 and Viewing Zenith Angles(VZA)

图9是以极坐标的方式对激光诱导叶绿素荧光偏振光谱的多角度空间分布进行绘制。 (a)— (f)分别表示在685与740 nm波段上, 吊兰(a, b)、 绿萝(c, d)、 金边虎皮兰(e, f)随角度变化引起的荧光偏振度的空间分布情况。 据图9可知, 激光激发的叶绿素荧光具有显著的偏振性。 随着观测天顶角的变化, 荧光偏振度随之改变; 随着相对方位角的变化, 荧光偏振度也随之变化。 在同一方位上, 随着观测天顶角的增大, 荧光偏振度的绝对值呈逐渐增大趋势, 这与前人的研究结论一致。 三种植物685与740 nm波段的荧光偏振度变化趋势基本一致, 但其偏振度的整体波动性程度各不相同, 其中三者波动性程度大小比较为: 吊兰< 绿萝< 金边虎皮兰。

图9

Fig.9

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	图9 在2π 空间内, 吊兰(a, b)、 绿萝(c, d)、 金边虎皮兰(e, f)在685和740 nm波段上偏振度的变化Fig.9 Changes in the degree of polarization of Chlorophytum (a, b), Green radish (c, d), Phnom Penh Tiger Piran (e, f) on the 685 and 740 nm bands in 2π space