共收集60份西红花样品, 其详细信息见表1, 所有样品经成都中医药大学严铸云教授鉴定西红花Croci stigma为正品; 红花、 菊花、 莲须、 玉米须和线状纸浆样品详细信息同样见附录表1。 西红花和常见染色伪品见附录图1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 西红花及其伪品的来源和数量信息 Table 1 The source and number information of saffron and its adulterants 样品名称 来源 数量 西红花 伊朗 40 西红花 上海 5 西红花 浙江建德 5 西红花 安徽亳州 5 西红花 河南永城 5 红花 成都市荷花池中药材市场 43 菊花 成都市荷花池中药材市场 20 莲须 成都市荷花池中药材市场 20 玉米须 农贸市场 20 纸浆 自制 20

表1 西红花及其伪品的来源和数量信息 Table 1 The source and number information of saffron and its adulterants

图1

Fig.1

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	图1 云端-互联PV500R-I便携式近红外仪主要工作示意图Fig.1 Main work diagram of cloud connected PV500R-I portable near infrared spectrometer

掺伪品制作: 在西红花中按质量比掺入伪品, 掺入百分比范围为: 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%和50%, 共15份, 平行制备两份, 一份为训练集, 一份为测试集。

云端-互联便携式近红外光谱系统主要由三部分构成: (1) 无线PV500R-I便携式近红外仪(长虹科技有限公司, 中国), 性能参数: 长宽高为110 mm× 70 mm× 70 mm; 重量为400 g; 光谱分辨率: 20 nm; 波长重复性为± 2 nm; 超大光斑70 mm× 70 mm。 (2) 移动手机。 (3) 云端数据库。 其工作示意图见图1, 便携式近红外光谱仪通过蓝牙与移动手机连接, 将扫描的样品光谱数据经移动手机上传至云端, 在云端通过已建立的预测模型快速计算未知样本类别或含量, 并将结果迅速反馈至手机端。

便携式近红外光谱仪经校正后, 将仪器直接贴于样品表面, 在1 350~1 850 nm波长范围内采集光谱图。 每个样品重复测定6次, 求平均光谱用于建模。

为使模型稳健, Kennard-Stone selection algorithm^[9]用于选择训练集(三分之二的样本量)和预测集(三分之一的样本量)。 由于各类别样本量有一定差异, 为避免产生更大的不平衡样本, 先对每类样本选择训练集和预测集, 后将所有类别样本的训练集和预测集各自相加, 得到最后的训练集和预测集。

标准正态变量转换(standard normal variable transformation, SNV)和光散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)是散射校正前处理技术, 常用于消除颗粒分布不均匀和粒径散射造成的影响, 同时也可消除光谱扫描时样品引起的光谱平移和随机噪声的影响, 从而提高模型预测能力^[10]。 采用一、 二、 三阶导数滤波器提高光谱分辨率, 消除原始红外光谱中的基线漂移和背景^[11]。

在全波段(1 350~1 850 nm)条件下, 利用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)建立西红花与其常见伪品的真伪鉴别模型。 用7折交叉验证的交叉验证均方根误差(RMSECV)的最小值确定最适隐变量数(LVs)。 最优模型选取原则: R²X, R²Y, Q^2[12], 内部预测准确率和外部预测准确率的值越大, 模型性能越好。 使用Simca(version 13.0, Umetrics, Sweden)软件完成PLS-DA模型的建立。

在全波段条件下, 建立五种西红花掺伪品掺入量的偏最小二乘回归(PLSR)定量预测模型。 根据变量与模型性能相关的回归系数大小, 选择最适回归系数及相应的重要波段对模型性能进行改进。 模型评价指标包括: 决定系数(R²), 均方根误差(RMSE), RMSECV, 预测均方根误差(RMSEP), R²越大, RMSE, RMSECV和RMSEP越小, 同时RMSECV与RMSEP之间差异越小, 表明模型性能越好。 使用Unscrambler (version 7.5, CAMO ASA, Norway)软件完成PLSR模型的建立。

图2(a)和(b)分别是西红花与其伪品, 西红花与其掺伪品在1 350~1 850 nm范围内的原始光谱图。 该光谱范围为C— H, O— H, N— H等基团伸缩振动的一级倍频区域^[13]。 直观上看, 西红花与其伪品之间的光谱存在一定交叉, 但各自有集中分布范围, 由上至下依次为红花、 莲须、 西红花、 菊花或玉米须, 表明西红花与伪品之间的原始光谱之间彼此存在一定差异, 这主要是由于各自的成分组成不一致导致。 比较特殊的是纸浆的近红外光谱图(黄色曲线), 其光谱曲线在1 560~1 660 nm范围有一个突降的过程, 产生原因可能是由于纸浆为工业产品, 其成分与其他植物源样品差异明显。 西红花与其伪品的光谱特点为西红花鉴别和定量分析提供了光谱基础。 西红花与其掺伪品在光谱图上同样存在各自的集中区域, 由上至下依次为红花、 玉米须或西红花或纸浆、 莲须、 菊花的近红外光谱, 但由于西红花在掺伪品中占比较大, 各类间的光谱曲线彼此重叠更加严重。

图2

Fig.2

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	图2 西红花与其伪品(a), 西红花与其掺伪品(b)的原始光谱图 a, b, c, d, e, f分别为西红花, 红花, 玉米须, 纸浆, 莲须, 菊花(以下图表中a, b, c, d, e, f均代表相同类别)Fig.2 The raw spectra of saffron and its adulterants (a), saffron and its adulterated saffron (b) The a, b, c, d, e, f are saffron, carthami flos, corn silk, pulp, nelumbinis stamen, chrysanthemi flos, respectively (a, b, c, d, e, f in the following chart represent the same category)

建模过程中发现同时有效区分西红花与其伪品和掺伪品十分困难, 因此, 分步为西红花与其伪品, 西红花与其掺伪品建立2个以上的识别模型。

2.2.1 西红花与其伪品识别模型

在全波段条件下, 用西红花与其伪品的原始数据和经五种数据处理方法(一阶导, 二阶导, 三阶导, MSC, SNV)处理后的数据建立六个PLS-DA模型, 其结果见表2, 图3, 附录表1和附录表2。 由附录表1和表2可知, 原始数据所建立的模型性能最优(R²X=1, R²Y=0.841, Q²=0.733, LV=13), 其对训练集和测试集的预测准确率均为100%, 而数据经前处理后所建立的模型并未改善, 这可能是光谱预处理时虽然降低了噪音, 提高了信噪比, 但也丢失了更为重要的信息。 附录表2为最优模型外部预测误分类表, 可知六类样本彼此间均能100%区分。 图3(a)为主成分1和2绘制的二维得分图, 可知主成分1对西红花、 纸浆、 红花彼此之间的准确区分起主要作用, 且纸浆与其他五类样本均能明显区分, 而主成分2对红花与玉米须, 红花与菊花之间的准确区分起主要作用。 同样, 由图3(a), (c)和(d)可知, 莲须与西红花、 玉米须与菊花、 红花与莲须均能有效区分。 图3(e)为模型的置换检验结果(R²=0.105, Q²=-0.341), 可知所有的蓝色Q²值均处于绿色R²值的下方, 表明模型可靠^[3]。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 在全波段条件下, 西红花与其伪品, 西红花与其掺伪品, 三类西红花掺伪品的最优PLS-DA模型结果, 详细结果见附录表1 Table 2 The best PLS-DA model results of saffron and its adulterants, saffron and its adulterated saffron, three kinds of adulterated saffron under the condition of full-spectra. Detailed results can be seen in table 1 of Supplementary Material 模型 数据 LV R2X R2Y Q2 内部预测准确率/% 外部预测准确率/% 西红花与其伪品 原始数据 13 1 0.841 0.733 100 100 西红花与其掺伪品 原始数据 17 1 0.739 0.527 91 89 三类西红花掺伪品 原始数据 5 1 0.632 0.554 98 96

表2 在全波段条件下, 西红花与其伪品, 西红花与其掺伪品, 三类西红花掺伪品的最优PLS-DA模型结果, 详细结果见附录表1 Table 2 The best PLS-DA model results of saffron and its adulterants, saffron and its adulterated saffron, three kinds of adulterated saffron under the condition of full-spectra. Detailed results can be seen in table 1 of Supplementary Material

图3

Fig.3

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	图3 西红花与其伪品的真伪鉴别PLS-DA模型结果 (a), (b), (c), (d)分别为主成分1和2, 主成分2和4, 主成分1和7, 主成分2和6所绘制的二维得分图; (e)为置换检验结果Fig.3 The PLS-DA model results of saffron and its adulterants (a), (b), (c), (d) are the two-dimensional score graph drawn by the principle components 1 and 2, 2 and 4, 1 and 7, 2 and 6, respectively, (e) is the result of permutation test

2.2.2 西红花与其掺伪品识别模型

用上述同样方法建立西红花与其掺伪品的六个PLS-DA模型, 结果见表2、 附录图2、 附录表1和附录表2。 附录表1和表录2表明原始数据所建立的识别模型最优(R²X=1, R²Y=0.739, Q²=0.527, LV=17), 其对训练集和测试集的预测准确率为分别为91%和89%。 置换检验结果(R²=0.237, Q²=-0.663)[见附录图2(d)]表明模型可靠。 分析附录表2可知, 除莲须掺伪品外, 模型能同时将其他四类掺伪品与西红花完全区分, 附录图2(a)表明主成分1与主成分2可将西红花与玉米须和纸浆完全区分, 附录图2(c)表明主成分1和主成分4可将西红花与菊花和红花完全区分, 表明四种西红花掺伪品的掺伪量识别水平可低至0.5%, 低于文献掺伪量识别最低水平(1%或5%)^{[3, 4]}。 莲须有四个掺伪量低的样品误判为西红花[见附录图2(c)和附录表3], 其识别水平为4%。 附录图2(b)和附表2表明玉米须与纸浆之间可完全区分, 玉米须和纸浆掺伪品两者识别率高于93%, 且其他三类掺伪品未与两者相混淆, 表明特异性高。 但红花和莲须掺伪品之间互有误判, 两者的识别率分别为80%和60%。 另外, 尽管菊花掺伪品的识别率为100%, 但有三个其他掺伪品误判为菊花, 在五类掺伪品中, 除莲须外, 菊花的特异性最差。

进一步为菊花、 红花和莲须三类西红花掺伪品建立识别模型。 结果见表2、 附录图3、 附录表1和附录表2。 由附录表1和表2可知, 原始数据建立的模型最优(R²X=1, R²Y=0.632, Q²=0.554, LV=5), 其对训练集和测试集的预测准确率分别为98%和96%, 错误分类表(见附录表2)表明3类掺伪品的识别率均在93%以上。 附录图3(a)表明菊花掺伪品能与红花和莲须完全区分, 附录图3(b)表明有一个莲须掺伪品误判为红花, 与附录表2中的结果一致。置换检验结果(R²=0.116, Q²=-0.302)[见附录图3(c)]表明模型可靠。

在全波段条件下, 对红花、 菊花、 莲须、 玉米须和纸浆五种西红花掺伪品掺伪量的原始数据和经五种数据前处理方法处理后的数据各建立六个PLSR定量预测模型, 其结果见表3、 图4和附录表3。 由附录表3和表3可知, 仅红花的最优模型为原始光谱数据提供, 其预测集R²为0.920, RMSEP为0.044。 其他四类掺伪品掺伪量的最优定量模型均由一阶导或二阶导提供, 其预测集R²均高于0.924, RMSEP低于0.041, 表明原始光谱数据经一阶导或二阶导前处理后, 更易获得最优模型。 同时, 模型的RMSECV值与RMSEP值之间差异较小, 表明五个模型可靠, 不存在过拟合。 图4表明五类西红花掺伪品外部预测集的掺伪量参考值和预测值所对应的点均匀分布于外部预测曲线两侧, 但当掺伪量范围低于9%时, 红花、 纸浆、 菊花、 玉米须和莲须的预测值与真实值相对误差分别高达372%, 203%, 61%, 42%和23%, 表明模型不适合预测掺伪量低的掺伪品; 当掺伪品掺伪量大于8%时, 红花、 菊花、 莲须、 纸浆和玉米须的相对误差分别低于8%, 8%, 3%, 10%和5%, 表明模型对五类掺伪品掺伪量能较好或很好的预测。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 在全波段条件下, 红花、 菊花、 莲须、 纸浆、 玉米须五类西红花掺伪品的掺伪量的最优PLSR定量预测模型结果, 详细结果见附录表3 Table 3 The best PLSR quantitative prediction model results of five kinds of adulterated saffron, i.e. carthami flos, chrysanthemi flos, nelumbinis stamen, pulp, corn silk, under the condition of full-spectra. Detailed results can be seen in table 3 of Supplementary Material 伪品 数据前处理 LV 校正集 交叉验证集 预测集 RMSCE R2 RMSECV R2 RMSEP R2 红花 原始数据 3 0.042 0.926 0.045 0.919 0.044 0.920 菊花 2阶导 2 0.013 0.993 0.017 0.989 0.014 0.993 莲须 1阶导 2 0.005 0.999 0.006 0.998 0.005 0.999 纸浆 1阶导 3 0.021 0.979 0.036 0.948 0.041 0.924 玉米须 2阶导 2 0.012 0.993 0.015 0.991 0.013 0.992

表3 在全波段条件下, 红花、 菊花、 莲须、 纸浆、 玉米须五类西红花掺伪品的掺伪量的最优PLSR定量预测模型结果, 详细结果见附录表3 Table 3 The best PLSR quantitative prediction model results of five kinds of adulterated saffron, i.e. carthami flos, chrysanthemi flos, nelumbinis stamen, pulp, corn silk, under the condition of full-spectra. Detailed results can be seen in table 3 of Supplementary Material

图4

Fig.4

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	图4 红花(a), 菊花(b), 莲央(c), 纸浆(d), 玉米须(e)五类西红花掺伪品的掺伪量的最优PLSR定量预测模型的外部预测结果Fig.4 The external prediction results of the optimal PLSR quantitative prediction model for the adulterants of carthami flos (a), chrysanthemi flos (b), nelumbinis stamen (c), pulp (d) and corn silk (e)

从全波段中选取重要变量建模通常能改善模型性能, 但仅红花掺伪品掺伪量的最优定量模型通过筛选重要变量, 其模型性能稍有改善, 其他四类的定量模型经变量筛选后所得模型性能反而变差, 原因可能是: (1)筛选的重要变量缺乏代表性, 一些次要变量在建模过程中同样不可或缺; (2)样品成分复杂, 导致一些重要特征变量被掩盖; (3)便携式近红外仪波段较窄(1 350~1 850 nm), 缺失了其他特征区, 如组合频区。 附录图4(a)为红花的变量与模型性能之间的回归系数图, 可知以± 0.01为界, 其重要变量为1 350~1 057, 1 383~1 398, 1 653~1 749和1 797~1 850 nm, 其模型性能(RMSECV=0.043, RMSEP=0.043)较原始模型(RMSECV=0.045, RMSEP=0.044)略有改善。