DNMT1抗原(OriGene公司); DNMT1小鼠单克隆抗体(McAb_DNMT1, abcam公司); DNMT1兔多克隆抗体(PcAb_DNMT1, abcam公司); 5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯荧光染料(5-TAMRA, 淄博昀辉生物化工技术有限公司); DNMT1商品化ELISA试剂盒(武汉云克隆科技有限公司); 羧基化磁性Fe₃O₄纳米球(50 mg· mL^-1, 百运纳米科技有限公司); N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(Sulfo-NHS, 分析纯, 阿拉丁公司); 碳二亚胺盐酸盐(EDC, 分析纯, 阿拉丁公司); Millipore超纯水(18.2 MΩ · cm); PBS磷酸盐缓冲液(0.01 mol· L^-1, pH 7.4); PBST缓冲液(0.05%Tween20)。

纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano-zs 90, 英国Malvern), 红外光谱仪(PE-1710, 德国PE), 荧光分光光度计(F-4500, 日本日立), 紫外-可见分光光度计(UV-1601, 日本岛津), 磁分离板(百运纳米科技有限公司)。

取100 μ L Fe₃O₄溶液, 磁分离, 用PBS清洗3次; 加入100 μ L McAb_DNMT1(0.1 mg· mL^-1)混匀, 分别加入100 μ L Sulfo-NHS和EDC, 涡旋20 min, 于25 ℃偶联2 h; 磁分离, 取上清用于计算偶联效率, 用PBS清洗2次。 加入300 μ L PBS(含0.5%BSA)震荡30 min封闭未活化基团, 分散于300 μ L PBS中, 4 ℃保存。

取100 μ L PcAb_DNMT1(0.25 mg· mL^-1)于装有1.0 mL PBS的离心管中, 混匀后加入5.0 μ L 5-TAMRA稀释液(27.4 nmol), 涡旋3 h偶联。 取400 μ L偶联物于预冷的超滤管(30KDa)中离心, 最后将超滤管倒置于离心管中, 离心回收检测探针。

在黑色96孔板中加入300 μ L封闭液, 37 ℃温育90 min后用PBST洗板3次; 每孔加入Fe₃O₄@McAb_DNMT1稀释液100 μ L(1:40), 磁分离后PBST洗3次。 加入100 μ L 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40和80 ng· mL^-1 DNMT1抗原, 37 ℃温育90 min, PBST洗板3次。 加入100 μ L 稀释20倍的5-TAMRA@PcAb_DNMT1溶液, 37 ℃温育90 min, PBST洗板5次。 加入200 μ L PBST, 测定96孔板中各孔的相对荧光强度(RFU), 以浓度为横坐标, 检测信号为纵坐标, 绘制标准曲线。

在参考文献[10]的基础上分别建立检测DNMT1的ELISA方法和MELISA方法。

检出限: 配制5个低于线性范围的DNMT1试样以及6个DNMT1空白样, 用FLISA检测, 求出 x̅± 3SD, 低浓度试样中RFU大于其所对应的测定值为方法检出限。

精密度: 取一块96孔板, 分别配制低、 中、 高浓度的样品, 每个水平平行6份, 按照1.4节的方法进行实验, 根据测定结果计算板内精密度; 同上, 取不同的96孔板, 计算板间精密度。

准确度: 配制三个浓度的DNMT1标准品, 按照1.4节中步骤进行测定, 将所得结果与加标浓度进行比较, 计算方法准确度。

特异性: 选取与DNMT1性质相似的DNA甲基转移酶DNMT3a和DNMT3b为检测对象, 在与测DNMT1相同的条件下测定RFU, 考察方法的特异性。

方法学比较: 用所建立的FLISA检测DNMT1含量, 并与MELISA和ELISA进行比较。

血清样本来自郑州大学第一附属医院呼吸与重症科室。 取15例肺癌患者的血清样品, 用FLISA方法检测DNMT1含量, 并将检测结果与商品化ELISA试剂盒进行比较。

FLISA测定DNMT1的原理见图1。 采用EDC/Sulfo-NHS键合法, 羧基功能化的Fe₃O₄磁珠为固相载体, 与McAb_DNMT1偶联制备免疫捕获探针, 加入DNMT1标准品或待测样品, 待测目标物被探针捕获并富集, 磁分离后加入标记有荧光检测探针5-TAMRA@PcAb_DNMT1, 此时形成双抗体夹心的“ 三明治” 结构, 磁分离。 用200 μ L PBST对磁性复合物进行悬浮, 于555 nm激发光照射下检测580 nm处的荧光强度, 根据荧光强度和目标物浓度的关系进行定量分析。

图1

Fig.1

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	图1 FLISA法检测DNMT1原理Fig.1 The detection of DNMT1 with FLISA

2.2.1 Fe₃O₄@McAb_DNMT1的红外光谱

按照1.2节中实验方法测定偶联效率, Fe₃O₄和McAb_DNMT1的偶联效率为76.3%。

图2为Fe₃O₄@McAb_DNMT1的红外图谱, 由图2可知: 与Fe₃O₄相比, Fe₃O₄@McAb_DNMT1在546 cm^-1处有Fe— O的特征吸收峰, 1 620 cm^-1是C=O的伸缩振动吸收峰, 3 360 cm^-1左右处是O— H和N— H的伸缩振动吸收峰, 1 000和1 650 cm^-1之间具有肽链的特征吸收谱带, 由此判断Fe₃O₄和McAb_DNMT1偶联成功。

图2

Fig.2

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	图2 Fe3O4@McAbDNMT1和Fe3O4红外吸收光谱Fig.2 The infrared absorption spectra of Fe3O4@McAbDNMT1 AND Fe3O4

2.2.2 Fe₃O₄@McAb_DNMT1的Zeta电位

捕获探针的Zeta电位分析结果见图3(a)。 从图3(a)数据可以看出, 羧基化的Fe₃O₄的Zeta电位-10.8 mV, Fe₃O₄@McAb_DNMT1的Zeta电位-8.45 mV, McA bDNMT1的Zeta电位-4.47 mV, 羧基Fe₃O₄与抗体偶联引起电位发生变化, 提示McAb_DNMT1成功偶联到Fe₃O₄上。

图3

Fig.3

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	图3 偶联物的Zeta电位Fig.3 Zeta potential of the Fe3O4@McAbDNMT1 and 5-TAMRA@PcAbDNMT1

2.2.3 Fe₃O₄@McAb_DNMT1免疫活性

用ELISA检测Fe₃O₄@McAb_DNMT1的免疫活性的实验结果见图4。 图中显示Fe₃O₄@McAb_DNMT1稀释比相同的情况下, 随着抗原浓度的增加吸光度逐渐增大; 在抗原浓度相同的情况下, 随着Fe₃O₄@McAb_DNMT1稀释比的增大吸光度逐渐减小, 表明在羧基化Fe₃O₄表面成功修饰了McAb_DNMT1, 并保持了抗体的活性。

图4

Fig.4

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	图4 Fe3O4@McAbDNMT1的免疫活性Fig.4 The immunocompetence of Fe3O4@McAbDNMT1

2.3.1 5-TAMRA@PcAb_DNMT1的紫外-可见吸收光谱

分别绘制5-TAMRA, PcAb_DNMT1及5-TAMRA@PcAb_DNMT1的紫外-可见吸收光谱, 如图5所示。 从图5中可以看出, 5-TAMRA的最大吸收峰为551 nm, PcAb_DNMT1在280 nm处有最大吸收峰, 5-TAMRA@PcAb_DNMT1在280 nm处和在555 nm均有吸收峰, 表明偶联成功。

图5

Fig.5

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	图5 5-TAMRA@PcAbDNMT1的紫外-可见吸收光谱Fig.5 The UV-Vis absorption spectra of 5-TAMRA@PcAbDNMT1

2.3.2 5-TAMRA@PcAb_DNMT1的Zeta电位

检测探针的Zeta电位测量结果见图3(b)。 从图3(b)可以看出, 5-TAMRA, PcAb_DNMT1和5-TAMRA@PcAb_DNMT1的Zeta电位分别为-1.950, 1.320和-0.968 mV。 5-TAMRA与抗体偶联后形成了偶联物导致Zeta电位发生变化, 提示PcAb_DNMT1与5-TAMRA偶联成功。

2.3.3 5-TAMRA@PcAb_DNMT1的激发光谱与发射光谱

5-TAMRA@PcAb_DNMT1的激发光谱与发射光谱分别见图6(a)和(b)。 由图6(a)可知, 5-TAMRA及其偶联物的最大激发波长为555 nm。 由于5-TAMRA在偶联的过程中有损失, 所以偶联物的荧光强度与5-TAMRA相比有所减弱。 由图6(b)可知, 5-TAMRA的最大发射波长是575 nm, 而偶联物的最大发射波长为580 nm, 发生了红移, 表明5-TAMRA与PcAb_DNMT1生成了新的偶联产物。

图6

Fig.6

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	图6 (a) 5-TAMRA@PcAbDNMT1的激发光谱; (b) 5-TAMRA@PcAbDNMT1的发射光谱Fig.6 (a) The excitation spectra of 5-TAMRA@PcAbDNMT1; (b) The emission spectra of 5-TAMRA@PcAbDNMT1

2.3.4 5-TAMRA@PcAb_DNMT1的免疫活性

利用抗原抗体的特异性结合进行免疫活性分析, 结果见图7, 随着抗原浓度的逐渐增加, 荧光强度随之增大, 表明5-TAMRA与PcAb_DNMT1形成了偶联物, 并保持了抗体的免疫活性。

图7

Fig.7

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	图7 5-TAMRA@PcAbDNMT1的免疫活性Fig.7 The immunocompetence of 5-TAMRA@PcAbDNMT1

2.4.1 FLISA标准曲线

方法的标准曲线如图8所示。

图8

Fig.8

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	图8 DNMT1的标准曲线Fig.8 Standard curve of determination DNMT1

2.4.2 FLISA检出限、 精密度、 准确度及方法学比较

FLISA, MELISA和ELISA检测DNMT1的方法学见表1、 所需时间见表2。 从表1数据可以看出, FLISA方法的检出限最低, 板内与板间精密度好、 准确度符合要求。 表2数据显示, 不同分析方法所需分析时间从短到长的顺序为: FLISA< MELISA< ELISA。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 三种分析方法的线性范围、 相关系数和检出限 Table 1 Linear range, correlation coefficient and detection limit of the three analysis methods 方法 线性方程 线性范围/ (ng· mL-1) 相关系 数(r) 检出限/ (ng· mL-1) RSD/% 回收率/% 板内 板间 板内 板间 FLISA y=222.046+48.323x 0.05~80.0 0.991 4 0.005 4.7~8.8 1.6~10.0 91.3~102.4 88.0~98.8 MELISA y=0.847+0.235x 0.05~25.6 0.991 9 0.040 3.7~7.6 4.6~6.2 82.7~96.5 81.5~114.4 ELISA y=0.678+0.171x 0.05~25.6 0.996 5 0.040 5.0~6.4 3.9~5.4 88.0~118.3 96.8~108.8

表1 三种分析方法的线性范围、 相关系数和检出限 Table 1 Linear range, correlation coefficient and detection limit of the three analysis methods

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 三种分析方法的反应时间 Table 2 Reaction time of the three analysis methods 方法 t/min 包板 封闭 温育抗原 温育检测抗体 显色 合计 FLISA - 90 90 90 - 270 MELISA - 90 90 90 20 290 ELISA 120 90 90 90 20 410

表2 三种分析方法的反应时间 Table 2 Reaction time of the three analysis methods

2.4.3 特异性评价

特异性分析结果见图9。 图9显示: 在DNMT1, DNMT3a和DNMT 3b浓度相同时, 测定DNMT3b的信号值约为DNMT1的1/7, DNMT3a的信号值更低, 方法的特异性良好。

图9

Fig.9

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	图9 FLISA方法检测DNMTs的特异性Fig.9 The specificity of detection DNMTs with FLISA

分别用FLISA和商品化ELISA试剂盒检测了15例人血清中DNMT1含量, 并用配对t检验对两种分析方法的测定结果进行了相关分析(t=1.906, p> 0.05), 差异无统计学意义。 相关性分析结果见图10所示, 说明所建立的FLISA法可以用于检测人血清样品中DNMT1的含量。

图10

Fig.10

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	图10 FLISA与ELISA测定结果的相关性分析Fig.10 The correlation analysis of FLISA and ELISA determination results