人胚胎干细胞株H1培养于培养板中, 培养基为mTeSR(STEM CELL Technologies)。 H1细胞克隆传代, 在37 ℃孵箱中孵育6~8 min, 加入DMEM/F12培养基洗3次, 收集细胞悬液, 1 000 r· min^-1离心5 min。 mTeSR培养基重悬后, 平均分入培养皿中。 H1单细胞传代, 使用1 mg· mL^-1 Accutase、 37 ℃消化细胞3 min。 DMEM/F12基础培养基重悬细胞悬液, 1 000 r· min^-1离心5 min。

急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液, 于37 ℃、 5% CO₂、 饱和湿度孵箱中培养。

选取天津血液病医院2016年急性早幼粒细胞白血病患者, 主要为2016年1月到6月在我院住院的患者, 其中男2例, 女2例, 年龄最小4岁, 最大46岁, 中位年龄43.5岁。 经骨髓穿刺, 并进行细胞形态学、 流式细胞术和电子显微镜等检查, 主要以细胞形态和组化为依据, 根据FAB确诊。

淋巴细胞分离液分离有核细胞, 部分细胞做常规电镜观察, 其余部分做髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)染色。 然后锇酸固定、 脱水、 浸透、 包埋、 切片和染色。 日立H-600(日本)透射电镜观察。 根据细胞结构分析, 按FAB形成电镜诊断。

将分离液分离的有核细胞或培养的细胞系细胞通过甩片机Cytospin4(Thermo Fisher Scientific, 美国)均匀涂于石英玻片上。 本研究采用共聚焦拉曼光谱仪XploRA Raman microscope(HORIBA Scientfic, 法国)对目的细胞检测。 以785 nm激光作为激发光, 功率为40 mW, 记录波数范围为600~1 800 cm^-1, 通过镜下观察, 随机选取一个目的细胞, 在扫描拍摄中通过× 40 0.75 NA尼康镜头将约40 mW激发激光束聚焦到样品上2 μ m× 2 μ m的光斑大小尺寸上。 每种白血病患者检测20~30个细胞, 每个细胞标本区域扫描累积时间为250 s, 分辨率为1 cm^-1。 应用Labspec6软件(BC Cancer Research Center, 加拿大), 平滑系数为1, 消除噪声信号、 去除荧光背景并对光谱进行平滑, 并在整个光谱区域校正多点基线。 所有光谱以各自的1 450 cm^-1拉曼峰进行归一化。

采用SPSS Statistics 20(IBM, USA)软件处理数据, 对人胚胎干细胞系、 急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和急性早幼粒细胞白血病患者(M₃)骨髓白血病细胞进行主成分分析、 判别分析和聚类分析。 应用主成分分析(principle component analysis, PCA)法对获得的拉曼光谱数据进行PCA。 应用判别函数分析(discrimination function analysis, DFA)对获取的主成分数据进行分析, 建立鉴别模型对ESCs, NB4和M₃患者白血病细胞的光谱数据进行鉴别, 应用交互验证(cross-validation)的方法对鉴别模型进行验证。 采用SIMCA-P (Ver 14.1, Umetrics, Umea, Sweden)软件对三组细胞进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)。 所有数据操作使用Origin(OriginLab, Northampton, MA)、 Graphpad Prism5(Graphpad Software, USA)和Volocity(Perkin Elmer, USA)软件进行。

从图1(a)吉姆萨染色的病理图中可以看出M₃细胞核不规则, 胞浆含大量颗粒。 图1(b)中NB4细胞胞浆少, 核质比大, 细胞核规则, 核仁不明显。 图1(c)中ES细胞胞浆稀少, 异染色质多, 核仁不明显, 无致密颗粒。 图1(d)的电镜结果显示M₃细胞富含颗粒, 内质网扩张。 图1(e)中NB4细胞颗粒少, 细胞核轻度不规则。 图1(f)中ES细胞核仁明显, 无颗粒。 M₃细胞胞浆内所含颗粒主要为MPO颗粒。 为了确认拉曼数据, 从形态学成像计算细胞核质比例。 我们从图1(a)— (c)选取20~24个细胞计算核质比例。 M₃, NB4和ES细胞的平均比例依次上升[图1(g)]。 通过形态学成像获得的数据与通过拉曼显微镜获得的数据一致。 然后通过TEM图像分析MPO含量。 在TEM图像中清楚地显示了含有亚细胞水平的MPO颗粒的分布[图1(d)— (f)]。 M₃细胞显示强烈的MPO活性[图1(d)]。 NB4细胞含有一些显示细胞质中MPO活性较弱的细颗粒[图1(e)]。 ES细胞中MPO的分布非常少[图1(f)]。 三种不同分化阶段白血病相关细胞中MPO含量的变化趋势与MPO带(1 581 cm^-1)收集的拉曼数据一致。

图1

Fig.1

Figure Option ViewDownloadNew Window

图1 三组细胞形态学分析结果 (a)— (c): M3, NB4, ES细胞瑞氏-吉姆萨染色结果; (d)— (f): M3, NB4, ES细胞透射电镜结果; (g): 数字化图像中M3, NB4, ES细胞核质比率计算结果; (h): M3, NB4, ES细胞MPO含量和核质比率平均值比较(* * p< 0.01)Fig.1 Morphological analysis of three groups of cells (a)— (c): Wright-Giemsa staining result of M3, NB4, ES cell; (d)— (f): TEM result of M3, NB4, ES cell; (g): Calculation of nucleocytoplasmic ratio of M3, NB4, ES cell in digitization images; (h): Comparison of averaged intensity of MPO content and nucleocytoplasmic ratio of M3, NB4, ES cell (* * p< 0.01)

本研究共获得不同分化阶段白血病相关细胞拉曼光谱181例, 其中ES细胞特征光谱29例, NB4细胞特征光谱25例, M₃细胞特征光谱127例(图2)。 细胞拉曼光谱的分子结构和峰位归属见表1。 在600~1 800 cm^-1的范围内可见三种不同分化阶段白血病相关细胞拉曼光谱呈现多个谱峰, 形态相近。 通过对比平均光谱, 获得差异性光谱, 显示不同种细胞间的拉曼光谱存在一定差异(图3)。 在M₃细胞和NB4细胞差异光谱中, M₃细胞在754, 781, 852, 1 003, 1 033, 1 121, 1 157, 1 215, 1 340, 1 551, 1 581 cm^-1等处对应的谱峰明显强于NB4细胞, 其中852, 1 003, 1 033, 1 157和1 551 cm^-1反映样本细胞内蛋白质的结构及含量, 781, 1 340, 1 581 cm^-1与核酸相关, 在这些波数处谱峰强度的变化表明M₃细胞中的DNA, RNA和蛋白质等物质的含量明显高于NB4细胞。 M₃细胞在754, 1 003, 1 121, 1 157, 1 173, 1 215, 1 340, 1 551和1 581 cm^-1等处的谱峰强于ES细胞, 表明前者核酸、 蛋白质、 脂类等物质的含量较高。 NB4细胞和ES细胞拉曼光谱的比较显示, 前者在622, 643, 781, 852, 934, 1 003, 1 340和1 581 cm^-1谱峰明显高于ES细胞, 其中622, 643, 852, 934和1 003 cm^-1与蛋白质有关, 781, 1 340和1 581 cm^-1与核酸组分有关, 提示NB4细胞内蛋白质和核酸等物质与ES细胞存在较大差异。 上述结果显示白血病细胞的整体活跃程度高于相对原始的胚胎干细胞, 这与PI3K/Aku/mTOR通路有密切关系。 例如mTOR复合物1(mTORC1)通过调控RNA翻译、 线粒体基因转录、 磷酸化线粒体蛋白、 参与糖酵解等方式, 控制线粒体活性和生物合成。 mTORC1也可促进磷酸戊糖途径相关基因表达来促进核酸生成。 mTORC1也可通过调节核糖体合成(mTORC1-S6K-S6通路)和mRNA的转录起始来调控蛋白质合成。 此外, mTORC1可通过激活脂肪合成基因的调控分子SREBP来促进脂肪生成。 更为重要的是, mTOR可以抑制细胞的过度自噬。 上述生物学过程解释了白血病细胞光谱在核酸、 蛋白质及脂类等物质谱峰强度高于ES细胞的原因。 电镜下观察到M3细胞胞浆中存在大量MPO颗粒, 数量明显高于NB4、 ES细胞。 MPO是一种含血红素辅基的血红素蛋白酶。 因此三组白血病相关细胞平均光谱在754, 1 121, 1 215和1 581 cm^-1峰位上存在明显的差异, 这对通过拉曼光谱鉴别三种白血病相关细胞具有潜在的应用价值。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 三组细胞平均拉曼光谱Fig.2 The mean spectrum of the three groups with Raman peaks

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 三组细胞的平均和差异谱 (a): M3, NB4; (b): NB4, ES; (c): M3, ESFig.3 The mean and difference spectrum of the three groups (a): M3, NB4; (b): NB4, ES; (c): M3, ES

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 细胞拉曼光谱的分子结构和峰位归属 Table 1 Molecular structure and peak assignments for Raman spectra of cells acquired Peak position/cm-1 MPO Nucleic Acids Proteins Lipids Carbohydrates 622 phenylalanine 643 tyrosine 728 A C— S CH2 rocking CH2 rocking 734 MPO 754 MPO 781 O— P— O, C, U, T 826 O— P— O stretch 852 tyrosine 879 Tryptopian 934 C— C 1 003 phenylalanine 1 033 Phenylalanine stretch 1 060~1 195 C— C stretch C— N stretch C— C stretch 1 087~1 101 C— C stretch C— C or PO2 stretch C— C stretch 1 117 C— N stretch 1 121 MPO C— C stretch glucose 1128 C— N stretch C— C stretch glucose 1 157 C— C(C— N) stretch 1 158~1 171 Tyrosine C— C (C— N) stretch 1 173 tyrosine carbohydrates 1 208 Tryptophan 1 215 MPO 1 240 Amide Ⅲ 1 250 Amide Ⅲ 1 300 CH2 deformation 1 313 CH3CH2 twisting CH3CH2 twisting 1 336 Polynucleotide chain 1 340 Polynucleotide chain 1 361 MPO 1 415 A, G2 1 437 CH2 deformation 1 450 CH2 binding 1 545~1 600 MPO 1 581 MPO Pyrimidine ring 1 596 MPO 1 658 Amide Ⅰ C=C deformation

表1 细胞拉曼光谱的分子结构和峰位归属 Table 1 Molecular structure and peak assignments for Raman spectra of cells acquired

通过对ES, NB4和M₃患者骨髓白血病细胞的光谱数据进行PCA分析, 从每张光谱1211个数据点提出79个主成分, 累积变异性97%。 将提取出的181张光谱数据的主成分进行DFA分析, 建立鉴别模型。 在DFA鉴别分类过程中, ES鉴别准确率为100%(29/29), NB4鉴别准确率为100%(25/25), M₃鉴别准确率为100%(127/127), 总体鉴别准确率达100%(181/181)。 本研究采用交互验证的方法对鉴别模型进行检验, ES鉴别准确率为100%(29/29), NB4鉴别准确率为96%(24/25), M₃鉴别准确率为99.2%(126/127), 而通过交互验证检验后鉴别模型的总体准确率达98.9% (179/181), 表明鉴别模型预测能力良好(表2)。 本文从3类细胞拉曼光谱结果中随机抽取30张特征光谱(每类10张), 组成三组数据。 图4显示3组数据的二维分布和三维分布, 表明应用PCA-DFA方法可以很好地鉴别ES, NB4和M₃患者骨髓白血病细胞的光谱数据。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 主成分分析结果 (a): 二维图; (b): 三维图Fig.4 PCA result (a): 2D plot using scores of PC1 and PC2; (b): 3D plot using scores of PC1, PC2 and PC3

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 基于PCA-DFA的三组细胞分类和交互验证结果 Table 2 Classification and cross-validation result of the three groups based on PCA-DFA Classification Resultsa, c Sample Predicted group membership Total ES NB4 M3 Original ES 29 0 0 29 Count NB4 0 25 0 25 M3 0 0 127 127 ES 100.0 0 0 100.0 % NB4 0 100.0 0 100.0 M3 0 0 100.0 100.0 Cross- validatedb ES 29 0 0 29 Count NB4 0 24 1 25 M3 0 1 126 127 ES 100.0 0 0 100.0 % NB4 0 96.0 4.0 100.0 M3 0 0.8 99.2 100.0 a: 100.0% of original grouped cases correctly classified; b: Cross validation is done only for those cases in the analysis. In cross validation, each case is classified by the functions derived from all cases other than that case; c: 98.9% of cross-validated grouped cases correctly classified.

表2 基于PCA-DFA的三组细胞分类和交互验证结果 Table 2 Classification and cross-validation result of the three groups based on PCA-DFA Classification Resultsa, c

系统聚类法是目前最常用的一种聚类方法。 使用前文所述方法从3类细胞拉曼光谱结果中随机抽取30张特征光谱(每类10张), 组成三组数据。 由图5可知, 该方法能很好地将ES细胞(1~10)、 NB4(11~20)和M₃细胞(21~30)拉曼光谱区分为三大类。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 三组细胞聚类分析树状图Fig.5 Dendrogram of cluster analysis of the three groups

为了更好的区分ES, NB4和M₃细胞的拉曼光谱差异, 区分这三种细胞的特异性生物标志物, 在PCA分析结果的基础上对数据进一步运用有监督的模式识别方法— — 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对样本数据进行分析比较。 如图6所示, 使用前文所述分组方法, 三种细胞被成功区分。 模型质量参数R²X=0.684, R²Y=0.979, Q²=0.937, 模型质量参数表示该模型概括了第一主成分(t[1])和第二主成分(t[2])两种整体信息的68.4%, 能解释因变量97.9%的变异信息, 模型可预测准确程度为93.7%。 三种细胞中起主要区分作用的峰位在于MPO相关峰(754, 1 121, 1 215和1 581 cm^-1)、 蛋白质相关峰(934, 1 003和1 450 cm^-1)以及核酸相关峰(826和1 340 cm^-1)。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 三种细胞的PLS-DA分析结果 粉红色, 绿色, 和蓝色数字分别与核酸, MPO和蛋白质相关Fig.6 PLS-DA result of the three groups (a): Score scatter plot; (b): Loading line plot; The pink, green and blue numbers are associated with nucleic acid, MPO and protein respectively; (c): Score column plot; (d): Loading column plot

为了进一步客观地验证三种细胞的拉曼谱峰差别, 在差异谱的基础上将三种细胞两两组合进行PLS-DA并分析载荷表征情况。 如图7(a)— (c)所示, 三种细胞被两两成功区分, PLS拟合参数如下: (a)R²X(cum)=0.634, R²Y(cum)= 0.99和Q²(cum)=0.966, (b)R²X(cum)=0.581, R²Y(cum)=0.991和Q²(cum)=0.941, (c)R²X(cum)=0.496, R²Y(cum)=0.99和Q²(cum)=0.945。 表明大部分方差由模型解释, PLS-DA得分图模型参数良好, 并且拟合程度良好。 使用这种方法, 我们清楚地将其他三种不同分化阶段细胞区分开。 通过载荷分析, ES细胞在核酸峰(781, 826和1 340 cm^-1)高于M₃细胞, 这与影像学观察到的ES细胞具有较高的细胞核与细胞质比率一致, 符合处于分化早期的原始细胞的一般特征。 MPO相关峰(754, 1 121, 1 215和1 581 cm^-1)是区分三种细胞的主要因素之一, 在M₃, NB4和ES细胞中的含量依次减少, 这一现象与三种细胞超微结构观察到的颗粒依次减少相符。 其余蛋白相关峰(622, 643, 852, 934, 1 003, 1 450和1 551 cm^-1)反映了三种细胞的活跃程度和增值代谢依M₃, NB4和ES顺序逐渐递减, 这与它们所处的分化阶段有关, 也与拉曼差异谱反映的信息一致, 但并非如MPO和细胞核质比率具有较高的特异性。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 三种细胞两两组合PLS-DA模型中的分类散点图和潜在变量负荷 粉红色, 绿色, 蓝色和黑色数字分别与核酸, MPO, 蛋白质和碳水化合物相关Fig.7 Score plot and loading plot for PLS-DA model from two combinations of the three groups (a— c) are score plots and (d— f) are loading plots The pink, green, blue and black numbers are associated with nucleic acid, MPO, protein and Carbohydrates respectively