紫外可见光谱仪(UV/Vis)型号(8453)、 温度控制仪型号(89090A)及操作软件(美国Agilent公司); 电子分析天平(Mettler Toledo公司); 离心过滤器型号(Ultra-15)(美国Millipore公司)二硫苏糖醇(DTT, C₄H₁₀O₂S₂)、 4, 4’ -二硫代二吡啶(4-PDS, C₁₀H₈N₂S₂)、 N-乙基马来酰亚胺(NEM, C₆H₇NO₂)、 氧化型谷胱甘肽(GSSG, C₂₀H₃₂N₆O₁₂S₂)、 连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)、 半胱氨酸(C₃H₇NO₂S)、 乙醇(CH₃CH₂OH)均为分析纯购于美国Sigma公司

将携带有人胞红蛋白(Cygb)基因的pET3a质粒按照分子生物学方法转化至C41(DE3)pLysS品种的大肠杆菌中进行基因表达^[9]。 按文献方法对表达产物中的胞红蛋白进行分离纯化, -80 ℃冰箱保存^[25]。

取几支分装好的Cygb样品, 将其合并于一个离心管中, 置于冰上, 加入过量二硫苏糖醇(DTT)反应约20 min用来打开在样品制备过程中形成的二硫键, 使得所有Cygb均以巯基形式(Cygb-SH)存在。 然后将该蛋白质通过Sephadex G-25凝胶柱, 用10 mmol· L^-1磷酸缓冲液洗脱以除去过量的DTT。 把所收集的Cygb-SH等分四份用于游离巯基的修饰: 第一份加入终浓度为2 mmol· L^-1 N-乙基马来酰亚胺(NEM)使其与巯基进行烷基化反应形成硫碳键(Cygb-SC); 第二份加入终浓度为4 mmol· L^-1 4, 4’ -二硫代二吡啶(4-PDS)使其与巯基反应促使Cygb二硫键形成(Cygb-SS), 4-PDS需要先用10%体积的乙醇溶解, 然后加入90%体积的缓冲液; 第三份加入终浓度为4 mmol· L^-1氧化型谷胱甘肽(GSSG)使其与巯基反应形成(Cygb-SSG); 第四份不加任何试剂维持自由巯基(Cygb-SH)的形式^[26](低温下可保持样品稳定), 以上反应均在室温下进行1 h。 反应完成后, 用Ultra-15离心过滤器浓缩样品, 最后将化学反应后的样品再次通过G-25柱以除去过量的小分子反应物。 收集所得样品, 取出少量用于检测, 其他样品置于-20 ℃保存。

采用半胱氨酸(Cys)作为巯基标准物, 精密称取一定量的半胱氨酸加入PBS缓冲液配置成浓度为1, 5, 10, 20和50 μ mol· L^-1巯基标准液。 精密称取4-PDS 4 mg先溶解于20 μ L乙醇中, 然后加入180 μ L PBS缓冲液配置成10 mmol· L^-1的母液。 分别向不同浓度的半胱氨酸加入终浓度为100 μ mol· L^-1的4-PDS使其反应15 min后作为样品进行检测。 打开紫外可见光谱仪, 分别对空白缓冲液、 不同浓度的Cys、 终浓度为100 μ mol· L^-1的4-PDS和不同样品进行200~800 nm全波长扫描, 空白缓冲液作为基线, 并记录Cys和4-PDS在324 nm处吸光值为A_324p和A_324r, 样品在324 nm处吸光值记为A_324s。 据文献报道, 反应物产物4-PT在324 nm处的消光系数Δ ε ₃₂₄=21 400 M^-1· cm^-1[27], 按照方程(1)可计算巯基浓度。

[SH]=A324s-A324r-A324pΔε324×1cm(1)

巯基浓度和半胱氨酸浓度的比值[SH]/[Cys]即为半胱氨酸中巯基数目。 半胱氨酸作为标准物可以用来检验该方法的可行性。

分别将四种经过修饰的Cygb取20 μ L分两组置于离心管中, 第一组分别加入280 μ L缓冲液, 第二组分别加入280 μ L终浓度为100 μ mol· L^-1的4-PDS溶液使其反应15 min后待测。 打开紫外可见光谱仪, 分别对空白缓冲液、 不同化学修饰的Cygb(Cygb-SH, Cygb-SC, Cygb-SS, Cygb-SSG)、 终浓度为100 μ mol· L^-1的4-PDS和四种与4-PDS反应后样品进行200~800 nm全波长扫描, 空白缓冲液作为基线, 并记录Cygb和4-PDS在324 nm 处吸光值A_324p和A_324r, 样品在324 nm处吸收值为A_324s。 同时记录不同修饰的胞红蛋白在416 nm处的吸光值A_{416 s}。 按照方程(1)可计算巯基浓度^[27]。

Cygb在416 nm处的消光系数Δ ε ₄₁₆=100 000 M^-1· cm^-1, 按照方程(2)可计算蛋白浓度。

[Cygb]=A416sΔε416×1cm(2)

巯基浓度和修饰的Cygb的比值[SH]/[Cygb]即为Cygb中巯基数目。

将携带有人Cygb基因的质粒转化至大肠杆菌中。 筛选含有该基因的阳性单菌落, 接种于少量肉汤培养基中培养, 并诱导其表达, 得到含有大量可溶性的Cygb的暗红色湿菌体。 将湿菌体裂解、 离心得到暗红色上清液, 依次通过HiPrep 16/10 DEAE FF阴离子交换柱和HiPrep 26/60 S-300HR聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱进行纯化。 用280, 400和416 nm三个波长同时检测, 结果如图2所示。

图2

Fig.2

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图2 胞红蛋白洗脱曲线 (a)胞红蛋白通过阴离子交换柱纯化图, 0~1 mol· L-1 NaCl缓冲液进行线性梯度洗脱; (b)胞红蛋白通过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱纯化图50 mmol· L-1 Tris-HCl (pH 7.5), 100 mmol· L-1 NaCl, 和 0.1 mmol· L-1 EDTA进行洗脱Fig.2 The cytoglobin elution curve (a) Purification of Cygb by anion exchange column, linear gradient elution with 0~1 mol· L-1 NaCl buffer; (b) Purification of Cygb by polyacrylamide gel column, elution with of 50 mmol· L-1 Tris-HCl (pH 7.5), 100 mmol· L-1 NaCl, and 0.1 mmol· L-1 EDTA

由图2可知, 经过两次过柱纯化, 可获得一定量纯度较高的胞红蛋白备用。

已知一个半胱氨酸分子中含有一个巯基, 因此选用半胱氨酸作为巯基标准物, 用来检验4, 4’ -二吡啶基二硫(4-PDS)测巯基方法的可行性。 已知半胱氨酸标准液浓度为1, 5, 10, 20和50 μ mol· L^-1, 按照上述方法使不同浓度的半胱氨酸与4-PDS反应, 然后做全波长扫描, 如图3所示。

图3

Fig.3

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	图3 半胱氨酸与4-PDS反应产物的光谱扫描图Fig.3 Spectral scans of cysteine and 4-PDS reaction products

记录324 nm吸光值, 按照方程(1)计算出不同浓度半胱氨酸中巯基的浓度。 结果如表1所示。

由表1得出半胱氨酸浓度与巯基浓度的比值接近于1, 意味着每个半胱氨酸上有一个巯基, 与事实相符。 验证了该方法的可行性。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 半胱氨酸浓度与测量的巯基浓度对比 Table 1 Comparison between the cysteine concentration and the measured sulfhydryl concentration 半胱氨酸浓度 /(μ mol· L-1) 324 nm处计算所得巯基 浓度/(μ mol· L-1) 两者 比值 1 1.22 0.82 5 5.31 0.94 10 10.48 0.95 20 21.61 0.93 50 51.83 0.96

表1 半胱氨酸浓度与测量的巯基浓度对比 Table 1 Comparison between the cysteine concentration and the measured sulfhydryl concentration

2.3.1 胞红蛋白与4-PDS反应时间的考察

按照实验方法1.5操作, 4-PDS的浓度为100 μ mol· L^-1, 分别和胞红蛋白反应15, 25和35 min后, 于波长324 nm处测量, 结果见图4所示。 结果证明, 从15~35 min, 巯基还原4-PDS的生成物4-TP较稳定, 吸光值变化不大。

图4

Fig.4

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	图4 胞红蛋白与4-PDS不同反应时间的光谱曲线Fig.4 Spectral curves of cytoglobin and 4-PDS with different reaction times

2.3.2 胞红蛋白巯基含量测定

按照实验方法1.5操作, 将四种胞红蛋白修饰样品分别与100 μ mol· L^-1的4-PDS溶液反应15 min, 反应所得产物4-PT扫描曲线如图5所示。

图5

Fig.5

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	图5 不同修饰的胞红蛋白样品与4-PDS反应产物光谱图Fig.5 Spectral curves of the products formed by the reaction of different modified cytoglobin samples with 4-PDS

由图5可得四种经过修饰的胞红蛋白样品在324 nm处吸光值, 根据方程(1)计算出样品中巯基浓度如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同修饰的胞红蛋白浓度与巯基浓度(n=3) Table 2 Different modified cytoglobin concentrations and sulfhydryl concentration (n=3) Cygb巯基浓度 /(μ mol· L-1) Cygb浓度 /(μ mol· L-1) 二者比值 每分子样 品巯基数 Cygb-SH 28.11± 1.73 15.42± 0.92 1.82± 0.02 ≈ 2 Cygb-SS 0.07± 0.02 6.43± 1.17 0.02± 0.01 ≈ 0 Cygb-SC 0.93± 0.07 9.31± 1.24 0.10± 0.05 ≈ 0 Cygb-SSG 9.18± 0.82 8.97± 1.03 1.00± 0.05 ≈ 1

表2 不同修饰的胞红蛋白浓度与巯基浓度(n=3) Table 2 Different modified cytoglobin concentrations and sulfhydryl concentration (n=3)

表2列出了Cygb样品中巯基浓度、 样品浓度及二者比值, 揭示了Cygb的修饰效果和样品中的巯基数目。 由表可知PDS和NEM几乎与Cygb的巯基全部反应, 由于空间位阻的存在, GSSG只与Cygb上的一半巯基反应。 对巯基进行化学修饰能够改变Cygb内在组氨酸的解离速率常数, 从而改变外在配体的结合常数, 影响Cygb结合外源配体的功能^[20]。

通过比较给定的胞红蛋白样品(通过朗伯-比尔定律测量)的浓度与同一胞红蛋白的游离巯基(通过4-PDS方法测的浓度来测定四种产物Cygb-SS, Cygb-SH, Cygb-SSG和量)Cygb-SC的纯度。 结果表明胞红蛋白样品巯基修饰的最终平均百分比> 90%。