实验样品于2018年7月滇池采集(东经102° 44'42.83″, 北纬24° 57'50″), 采集后的水体样品经玻璃纤维滤膜(0.45 μ m, GF/F, Waterman, UK)(450 ℃灼烧4 h)过滤, 得到的上清液即为DOM溶液。 经测定滇池水体原位pH为8.30, 与滇池表层水体pH均值一致。 使用HCl与NaOH调节溶液pH值分别为4.0, 5.0, 7.0和9.0, 并在实验期间用1 mol· L^-1 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、 羟乙基呱嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液维持pH值恒定。 将DOM溶液分装于石英锥形瓶后(用5%硝酸浸泡24 h, 超纯水冲洗净后120 ℃高温灭菌1 h), 置于紫外灯装置中(紫外功率120 W, λ =300~320 nm, 温度22 ℃)进行降解实验, 降解的0, 2, 8, 15和30 d取样, 每次取三个平行样, 留待紫外-可见光光谱与三维荧光光谱测定。

紫外-可见光光谱测定采用UV-Vis 8453紫外可见光分光光度计(Agilent Technologies, Wilmington, DE, US)扫描全波长, 扫描范围200~800 nm。 以Milli-Q作为纯水空白。 每个波长的吸光度通过减去700 nm处的吸光度进行基线校正。 吸收系数的计算如式(1)所示

a(λ)=2.303abs(λ)/L(1)

式中, a(λ )为波长λ 处的吸收系数, m^-1; abs(λ )为波长λ 处的吸光度; L为光程路径, m。

三维荧光光谱测定采用荧光分光光度计(PerkinElmer Precisely LS55, UK)测定。 测定模式选择3-D Scan, 激发波长范围设定为200~450 nm, 发射波长范围为250~550 nm, 增量均设为2 nm, 光谱带宽均设为10 nm。 拉曼效应通过Milli-Q超纯水为空白, 将测定结果扣除Milli-Q超纯水空白谱图进行校正; 散射峰的消除采用Stedmon和Bro (2008)^[8]的方法, 将散射区域的数值赋值为0。 荧光峰强度除以350 nm激发波长处纯水的拉曼峰面积(发射波380~420 nm), 单位换算为R.U.。

在MATLAB 2010a中使用DOMFluor工具箱运行PARAFAC模型样品的三维荧光数据进行分析。 PARAFAC法是通过数学统计的方法把DOM复杂的荧光数据矩阵分离出不同的组分, 将所有点位的整个三维荧光数据组分解成3个线性项和一个残留数组, 它是基于三线性理论的一种方法.在拟合PARAFAC模型时为减少样本偏差, 每个EEM都除以它的总荧光。 对模型进行拟合后, 将结果与原总荧光相乘, 反转归一化后再进行动力学分析。

采用SPSS 11.5进行均值、 标准差、 标准误等数据统计分析, 采用Origin 2017完成绘图。

不同pH值降解条件下DOM的紫外-可见吸收系数随时间变化特征如图1所示。 不同pH值的光降解条件下, 在波长200~600 nm范围内, 吸光系数均随波长的增加而呈指数下降趋势。 在pH值为4.0和7.0时, 样品吸光系数随降解时间延长而逐渐降低, 与马琼琳等^[9]所做的降解实验中吸收光谱单调衰减的趋势一致。 在0~30 d的降解过程中, DOM吸光系数随pH值的增大而增大(图1所示), 可能是因为pH值增大导致DOM结构膨胀, 暴露出较多的显色基团, 导致其吸光系数变大^[10]。 具有不饱和共扼双键结构的芳香族化合物含量降低, 会导致紫外光谱的吸光系数减小, 推测本实验样品吸光系数随时间的延长而减小可能是因为有芳香族化合物发生降解^[11]。

图1

Fig.1

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	图1 不同pH值样品DOM吸光系数随时间变化特征 (a): 0 d; (b): 8 d; (c): 15 d; (d): 30 dFig.1 Spectral absorption coefficients of DOM under different pH values at time (a): 0 d; (b): 8 d; (c): 15 d; (d): 30 d

a₃₅₀表示DOM的相对含量, 不同pH值降解条件下其随时间变化情况如图2(a)所示。 降解至第2天观察到: pH 5.0, pH 7.0和pH 9.0的样品a₃₅₀较0天相比, 显著增加, 即降解条件pH 5.0, pH 7.0, pH 9.0的样品DOM相对含量增加, 可能由于水样DOM在这3种降解条件下发生了光腐殖化过程, 导致DOM积累^[12]。 降解实验进行至30 d时, 不同pH值降解条件下a₃₅₀均有不同程度的降低, 在pH 4.0~9.0条件下的降低率分别为70.06%, 44.80%, 50%和63.89%, 表明不同pH实验条件下样品的DOM相对含量在30 d的降解作用下均有不同程度的损失, pH 4.0的降解条件下DOM相对含量损失最大。 E₂/E₃(波长250 nm和波长365 nm处紫外吸光系数的比值)与相对分子量的大小成反比^[12], 其变化如图2(b)所示。 实验0天至第2天, 各pH条件下的E₂/E₃均有不同程度的降低, 其中pH 7.0的降解条件对E₂/E₃影响最显著, E₂/E₃下降60.66%。 可见初始2天的降解实验对DOM相对分子量变化影响显著, 使得DOM小分子量物质转化成分子量相对较大的物质。 第2天至第30天的实验中E₂/E₃无变化, 表明第2天至第30天的降解实验对DOM相对分子量无显著影响, 同时E₂/E₃的值也并未对不同pH值降解条件变化表现出明显差异性。 S_275~295值(波长275~295 nm范围内吸光度自然对数值与波长线性关系的斜率)与DOM芳香碳含量成反比^[12], 其随降解时间变化如图2(c)所示。 在0天至第2天的降解实验中S_275~295值缓慢下降, 第2天至第15天S_275~295值缓慢上升, 第15天至第30天保持稳定。 S_275~295值上升表明样品DOM芳香性减弱, 芳香化合物被降解。 与Du等^[13]所做的EEM-PARAFAC分析湖泊光降解反应的实验结论一致。

图2

Fig.2

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	图2 不同pH值a350(a), E2/E3 (b), S275~295 (c)等指数随时间变化特征Fig.2 Temporal changes of a350 (a), E2/E3 (b), S275~295 (c) under different pH values

有文献报道紫外照射可以将芳香族化合物等大分子有机物转化成小分子物质^[12]。 通过本研究的紫外-可见光谱结果可以推测: 在0~2 d的降解实验中, 生成的大分子物质为芳香族化合物, 第2天至第15天芳香族化合物又在紫外辐照下发生降解, 与pH值4.0和7.0条件下, 样品DOM吸光系数随时间延长而降低可能是因为有芳香族化合物发生降解的结论相吻合。

在不同pH (4.0, 5.0, 7.0, 9.0)影响下, 光降解实验0天(a— d) 和30天(e— h) 的三维荧光光谱特征变化如图3所示, 基于传统的EEMs分峰技术^[14], 本实验样品可分为腐殖质峰和类蛋白峰。 降解前在紫外范围内Ex_max=249~265 nm, Em_max=420~450 nm观察到类腐殖质特征荧光峰, A峰; 在可见范围内Ex_max=313~323 nm, Em_max=390~402 nm观察到长波类腐殖质特征荧光峰, M峰, 代表湖泊类腐殖酸; 在Ex_max=225~230 nm, Em_max=337~345 nm处出现类色氨酸特征荧光峰, T峰; 在Ex_max=207~217 nm, Em_max=293~303 nm处出现酪氨酸特征荧光峰, B峰。 在降解实验的第2天, 不同pH值降解条件下, 都出现M峰向腐殖质C峰(Ex_max=338~348 nm, Em_max=428~434 nm)转化的现象, 即特征峰发生红移。 前人在研究pH值对腐殖质光谱特征影响的实验中也发现了这种红移现象(荧光峰向激发和发射波长较长的方向移动的现象)。 例如在徽山湖水体DOM降解实验中^[15]发现, 紫外光照条件120 h后富里酸特征峰A峰蓝移的现象(最大峰向短波长方向移动), 可见光区的富里酸特征峰C峰红移。 Mobed等^[16] 在探究pH值对腐殖质的荧光特征影响实验中也发现了这种红移的现象, 推测红移可能是由于短波长区域内荧光发射的内滤波衰减, 即短波长处的高吸光度造成的。 可见腐殖质极易受pH值的影响而发生形态转化, 从而影响其荧光特性。 第30天[如图3(e— h)所示], pH值9.0条件下, 代表酪氨酸的B峰突然消失, 一定程度上表明在pH值9.0条件下, 蛋白类物质特别是酪氨酸极易被分解。

图3

Fig.3

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	图3 不同pH值(4.0, 5.0, 7.0, 9.0)作用下DOM在0天(a— d)和30天(e— h)的EEMs光谱Fig.3 EEMs spectral characteristics for DOM at day 0 (a— d) and day 30 (e— h) under various pH values

荧光指数FI值(Ex波长为371 nm时, Em波长分别为450和500 nm处荧光强度的比值, 与DOM芳香性呈负相关关系^[17]), 如图4(a)所示。 由图4(b)可以看出: BIX(Ex波长为310 nm时, Em波长分别在380和430 nm处的荧光强度的比值)指数随降解时间延长而逐渐降低, 降解30天时样品BIX值下降至0.6左右, BIX值低于0.6表示含有少量蛋白物质^[18]。 综上所述, pH值对降解过程中FI值和BIX值的影响不大。 HIX指数与DOM的腐殖质含量成正比, 本实验中HIX(Ex波长为254 nm时, Em波长分别在435~480与300~345 nm范围内荧光强度总和的比值, 可反映DOM腐殖化程度和芳香性^[15])值随降解时间延长而降低, 即腐殖质含量逐渐减小, 腐殖化程度逐渐降低, 表明腐殖质物质发生了光降解。 综合分析荧光指数结果, 表明水体DOM在紫外辐照下发生了大幅度降解, 对比2.1中pH值9.0条件下30天后酪氨酸被分解的结论可知, 蛋白类物质极易被降解。

图4

Fig.4

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	图4 pH值对FI(a), BIX(b)和HIX(c)的影响Fig.4 Effects of pH values on the indexes of FI(a), BIX(b) and HIX(c) during photodegradation

将得到的DOM三维荧光样品数据放入PARAFAC模型中模拟, 通过折半分析和随机初始化方法来验证模拟结果的可靠性, 识别出3个组分的荧光强度, 并以F_max(R.U.)来表示, 各荧光组分特征如图5(a— f)所示, 各荧光组分的最大激发和发射波长及其荧光类型和主要特征如表1所示。 C1组分(Ex_max=325 nm, Ex_max=425 nm)是天然水体中常见的DOM组分, 属长波类富里酸, 通常认为是UVA类腐殖酸, 对应传统分峰法的C峰^[19]。 C2组分(Ex_max=295 nm, Ex_max=398 nm)与传统寻峰法中的M峰^[20]的位置比较接近。 C2组分的位置也与河口DOM三维荧光表征实验^[21]中的色氨酸荧光峰(Ex_max=280 nm, Ex_max=344 nm)相似, 对应传统分峰法中的T峰。 因此推测, C2组分可能为腐殖质M峰与色氨酸组分结合形成的与光降解产物相关的物质。 C3组分存在两个最大激发波长分别为260和350 nm, 两个最大发射波长分别为360和450 nm, 属于UVC类腐殖质组份, 对应于传统寻峰法的A/C峰, 反映了该组分是具有大分子量的腐殖质, 且具有高芳香度特性^[22]。 综上所述, 本研究中的三个荧光组分主要为类腐殖质和蛋白类物质两大类。 有研究^[23]利用PARAFAC分析滇池水体DOM的三维荧光光谱特征得到了四种有效组分, 也归为两大类: 类腐殖质和类色氨酸类物质, 这种差异主要是由于研究中采用的样品直接来源于滇池水体DOM, 未做任何处理, 而本研究中进行PARAFAC分析的DOM样品主要来源于不同pH值条件下光降解过程中产生的内源DOM。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 光降解作用下各组分的荧光特征 Table 1 Stral characteristics of excitation and emission maxima of three fluorescent components under various pH values by PARAFAC modeling, compared with those from previously identified results 三维荧光组分 Exmax/nm Emmax/nm 文献[14, 23] 与文献对比 特性描述 C1 325 425 C: Exmax=338~348, Emmax=428~434 C3: Exmax=315; Emmax=440a 类富里酸 C2 295 390~405 M: Exmax=313~323, Emmax=390~402 T: Exmax=225, Emmax=337~345 B: Exmax=207~217, Emmax=293~303 C3: Exmax=295; Emmax=398b C5: Exmax=280; Emmax=344a 光降解产物与类色氨酸有关 C3 260(350) 360(450) A: Exmax=249~265, Emmax=420~450 C6: Exmax=350; Emmax=444a 大分子腐殖质, 高芳香度特性 a Osburn et al. (2012)[21]; b Stedmon and Markager(2005b)[24]

表1 光降解作用下各组分的荧光特征 Table 1 Stral characteristics of excitation and emission maxima of three fluorescent components under various pH values by PARAFAC modeling, compared with those from previously identified results

图5

Fig.5

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	图5 PARAFAC分析得到的DOM三个组分的荧光特征(a, b, c)及其折半检验图(e, f, g)Fig.5 Three fluorescent components (a, b, c) identified by PARAFAC and corresponding split-half validation lodings (e, f, g)

为了更好地对比荧光强度的变化趋势与特征, 将不同时间不同pH值条件下的荧光数据进行标准化处理, 均表述为0天荧光强度的百分比, 结果如图6(a)所示。 从图中可以看出, 经过30天的降解, 不同pH值条件下DOM总荧光强度均随时间增加而下降。 此外, pH值从4.0增加到9.0, 总荧光强度随pH值增加逐渐下降, 表明随着pH值的增加, 光降解能力增强, 这与前人的研究结果基本一致^[25]。 Timko等^[25]调查研究了不同pH值(范围4.0~8.0)对Suwannee River来源DOM样品光降解特征的影响, 结果发现随着pH值的增加, 总荧光强度显著下降, DOM的光降解作用增强。 这可能是由于pH值增大, 促进了DOM分子结构中的酚类基团发生去质子化作用, 从而促进了光降解作用^[26]; 此外, pH值增大导致DOM分子构象发生变化即其表面积膨胀, 更易受活性氧自由基的攻击, 从而促进光降解作用^[10]。 C1, C2和C3组分随时间和pH值变化的结果如图6(b— d)所示。 从图中可以看出, 三组分的荧光强度均随时间延长而逐渐下降, 其中C2组分从降解的第8天开始, 其荧光强度随pH值增加逐渐下降, 而C1和C2组分荧光强度随pH值的增大没有表现出明显的变化趋势。

图6

Fig.6

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	图6 pH值对总荧光强度(d)及三个组分C1(a), C2(b)和C3(c)荧光强度的影响Fig.6 Effect of pH values on total fluorescence intensity (d) and the fluorescence intensity of three fluorescent components C1(a), C2(b) and C3(c)

研究发现pH值对DOM光降解作用的三维荧光光谱特征产生了重要影响, Timko等的研究也表明: DOM光降解过程中, pH值对其三维荧光强度具有重要影响, 高pH值能够促进DOM的光降解作用。 因此, 在对比不同来源DOM(自然水体、 DOM提取物等)三维荧光和平行因子分析结果时, 必须考虑pH值的影响, pH值要保持一致, 否则对比结果具有很大差异。