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易守军, 何盼, 欧宝立, 张敏, 夏晓东, 唐春然, 曾云龙. 适配体传感法快速测定啤酒中赭曲霉毒素A[J]. 光谱学与光谱分析, 2019,39(7): 2283-2287.
YI Shou-jun, HE Pan, OU Bao-li, ZHANG Min, XIA Xiao-dong, TANG Chun-ran, ZENG Yun-long. A Novel Aptasensors Assay for Fast Detection of Ochratoxin A in Beer[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2019,39(7): 2283-2287.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2019)07-2283-05  
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适配体传感法快速测定啤酒中赭曲霉毒素A
易守军, 何盼, 欧宝立, 张敏, 夏晓东, 唐春然, 曾云龙*
湖南科技大学材料科学与工程学院, 湖南科技大学化学化工学院,理论有机和功能分子教育部重点实验室, 湖南 湘潭 411201
*通讯联系人 e-mail: yunlongzeng1955@126.com

作者简介: 易守军, 1973年生, 湖南科技大学材料科学与工程学院讲师 e-mail: tyishj@163.com

收稿日期: 2018-05-08 接受日期: 2018-10-10
基金: 国家自然科学基金项目(21475040), 湖南省教育厅资助项目(11C0528)资助
摘要

应用自组装方式, 构建了金纳米粒子/核酸适体/氨基碳量子点荧光传感赭曲霉毒素A高灵敏检测方法。 在pH 3.0酒石酸-HCl缓冲溶液中, 巯基修饰的赭曲霉毒素A核酸适体在金纳米粒子表面自组装, 形成金纳米粒子/核酸适体复合物, 再在pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中, 氨基碳量子点在金纳米粒子/核酸适体复合物上自组装, 形成金纳米粒子/核酸适体/氨基碳量子点复合物荧光传感检测体系。 金纳米粒子的摩尔吸光系数大、 能带宽使其具有强烈的荧光猝灭功能, 氨基碳量子点形成金纳米粒子/核酸适体/氨基碳量子点后发生荧光猝灭, 此时体系的荧光为背景荧光, 其强度记为 F0; 由于金纳米粒子/核酸适体/氨基碳量子点复合物荧光传感检测体系中核酸适体对赭曲霉毒素A具有特异性识别与结合功能, 向金纳米粒子/核酸适体/氨基碳量子点复合物荧光传感检测体系溶液中加入赭曲霉毒素A后, 赭曲霉毒素A则与复合物中核酸适体立即发生特异性结合并释放出氨基碳量子点, 体系荧光恢复, 其荧光强度记为 F。 依据体系荧光强度的变化( F- F0)与赭曲霉毒素A浓度之间的关系, 建立赭曲霉毒素A核酸适体荧光传感检测方法。 研究了金纳米粒子和核酸适体摩尔比、 孵化时间、 pH等因素对传感器性能的影响, 确定了最优条件为金纳米粒子:核酸适体 t为1:190、 孵化时间为6 min、 pH 7.0时; 在最优条件下, 赭曲霉毒素A浓度在0.005~1.00 ng·mL-1范围与体系荧光强度变化呈良好线性关系, 线性回归方程为: F- F0=6.499+211.6 c( c为赭曲霉毒素A的浓度, 单位: ng·mL-1), 相关系数 r为0.995 5, 按3倍标准差与工作曲线的斜率的比值(3 σ/k)计算, 得检测限为3 pg·mL-1。 在实际样品中的回收率在93.3%~108.9%, 相对标准偏差小于5%, 能满足啤酒样品中赭曲霉毒素A快速检测要求。 对13个市售啤酒样品进行检测, 其中6个样品检出赭曲霉毒素A, 污染率为46.15%。 受污染样品的赭曲霉毒素A含量在0.008~0.63 ng·mL-1范围。 该荧光传感法检测赭曲霉毒素A具有灵敏性好、 特异性高、 常见真菌毒素无干扰、 方法简单、 快速, 便于大众化推广应用的优点。

关键词: 核酸适体传感; 荧光探针; 啤酒; 赭曲霉毒素A; 痕量检测
中图分类号:O611.4 文献标志码:A
A Novel Aptasensors Assay for Fast Detection of Ochratoxin A in Beer
YI Shou-jun, HE Pan, OU Bao-li, ZHANG Min, XIA Xiao-dong, TANG Chun-ran, ZENG Yun-long*
School of Materials Science and Engineering of Hunan University of Science and Technology, School of Chemistry and Chemical Engineering of Hunan University of Science and Technology, Key Laboratory of Theoretical Organic Chemistry and Functional Molecule, Ministry of Education, Xiangtan 411201, China
Abstract

In this paper, a novel highly sensitive fluorescent aptasensor was constructed and used to detect ochratoxin A based on gold nanoparticles/aptamer/amino-functioned carbon quantum dots by using self-assembly. Gold nanoparticles/aptamer/amino-functioned carbon quantum dots were prepared as following. First, thiol-modified aptamer was attached to the surface of the gold nanoparticles in pH 3.0 tartaric acid-HCl buffer to form gold nanoparticles/aptamer by assembling. Second, amino- functioned carbon quantum dots were added to the gold nanoparticles/aptamer dispersion to form gold nanoparticles/aptamer/amino-functioned carbon quantum dots under electrostatic interactions in phosphate buffer solution (pH 7.0), by removing the excessive amino-functioned carbon quantum dots with centrifugation. The fluorescence of the amino-functioned carbon quantum dots was efficiently quenched by the gold nanoparticles, which are excellent quencher for fluorescence sensing as they have very high molar extinction coefficients and broad energy bandwidth. The fluorescent intensity of the quenched system was background fluorescence ( F0). When ochratoxin A was addition to the fluorescence quenched system, the specific reaction between aptamer in the nanocompostes and ochratoxin A took place, simultaneously, amino-functioned carbon quantum dots were released, and a turn on amino-functioned carbon quantum dots fluorescence signal ( F) was detected. The emission intensity increase ( F- F0) could be used for the quantification of the amount of ochratoxin A in samples. The influence facts on the sensor performance were investigated including the molar ratio of gold nanoparticles and Apt, pH and incubation time. The optimum conditions were gold nanoparticles:aptamer=1:190 in molar ratio, pH 7.0 and incubation time was 6 minutes. Under the optimum conditions, a linear fluorescence signal response to ochratoxin A concentration was over a wide ochratoxin A concentration range of 0.005~1.00 ng·mL-1. The linear regression equation is: F- F0=6.499+211.6 c(ng·mL-1), linear correlation coefficient is: r=0.995 5 with a diction limit of 3 pg·mL-1 according 3 σ/k ( σ: relative standard deviations, k: slope of the working curve). The recovery was between 93.3%~108.9% in real samples, and the relative standard deviation was less than 5%. The proposed method was employed to detect ochratoxin A in beer samples, the results showed that ochratoxin A was found in 6 of 13 beer samples, with a positive rate of 46.15%. The concentration of ochratoxin A was in the range of 0.008~0.63 ng·mL-1. The fluorescent apasensor method used to detect ochratoxin A has the advantages of highly sensitive, highly specific, without interference of common mycotoxins, simple, very fast, convenient for popularization and application.

Keyword: Aptasensors; Fluorescence probes; Beer; Ochtatoxin A; Trace detection
引 言

量子点具有优异的荧光特性, 常见的如CdTe和CdSe等镉系量子点[1]。 镉系量子点具有半峰宽窄、 荧光量子效率高, 最大发射峰可调控等突出优点, 在环境科学、 分析化学、 化学生物传感、 成像等诸多领域得到广泛应用[2]; 但该类量子点制备成本高、 前体原料来源有限、 具有生物和环境毒性、 应用时存在二次污染的风险[3], 因此开发和应用新型量子点一直是研究的热点。 碳量子点是近年来开发应用的新型量子点之一。 碳量子点具有制备方法简单、 成本低廉、 环境友好、 生物兼容性好、 碳源丰富等的优点, 其应用研究引起人们的广泛关注[4]。 由于碳量子点的表面电荷改变或发生能量转移等可引起其荧光强度变化; 碳量子点的这一特性, 已被成功地应用于构建荧光传感器[5, 6, 7], 其优良性能在环境毒害物质检测、 食品药品安全监测等领域具有应用潜力。

核酸适体具有高特异性。 与酶、 抗原/抗体相比, 核酸适体具有稳定性好、 制备简单、 成本低廉等特点, 广泛应用于环境监测、 疾病诊断和食品药品安全监测[8]。 核酸适体本身光电信号弱, 在实际应用中, 需要通过适当方法进行信号放大。 目前主要有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增法、 荧光材料标记法等[9]建立的荧光传感等检测方法。 PCR扩增法通常嵌入荧光染料或探针实现信号放大, 荧光染料嵌入法伴随非特异性嵌入, 影响方法的正确性, 而探针法价格昂贵。 荧光材料标记法通常采用荧光素或发光纳米粒子对核酸适体进行标记, 而对其互补链修饰猝灭物质(如金纳米粒子等), 两者结合形成发夹型, 发光荧光物质与荧光猝灭物质靠近, 荧光猝灭, 当待分析组分存在时, 待分析组分选择性地与核酸适体作用, 发夹打开而恢复荧光。 该法存在核酸适体修饰价格高昂、 分析程序较为复杂、 技术要求高、 检测成本高等不足, 不易大众化推广应用。

啤酒通常用麦芽等发酵制备。 生产麦芽的原料大麦等通常易受赭曲霉、 纯绿青霉等真菌污染, 它们的代谢产物赭曲霉毒素A(OTA)具有致癌致畸和强的肝肾毒性; 这些真菌毒素在麦芽生产、 发酵过程中还可继续生长造成进一步污染。 啤酒中广泛存在OTA污染问题, 李楠等[10]调查了国产11个品牌79个啤酒样品, 其中38个啤酒样品受到OTA污染, 污染率为48.1%。 OTA很稳定, 在人体中半衰期为35.5 d。 人们通过饮用啤酒, 使OTA进入人体, 并产生累积效应, 对人体造成持续毒害作用。 啤酒是一种大众喜爱饮料。 尤其在夏天, 一些人每天要喝数升啤酒, OTA对人体产生的影响不可忽视。 然而, 我国有关啤酒中OTA检测的文献很少。 目前食品药品中痕量OTA检测方法主要有色谱法和酶联免疫法[11, 12]等。 酶联免疫法价格高; 色-质联用法仪器设备昂贵、 技术要求高、 需专门技术人员才能胜任。 因此, 建立简单、 快速、 灵敏的啤酒中OTA测定方法对食品安全和保障人们身体健康具有重要意义。 本工作拟结合核酸适体的高特异性和碳量子点的优异荧光特性, 在金纳米粒子表面进行自组装, 建立简单、 快速、 灵敏度高的啤酒中OTA传感检测新方法。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

巯基-OTA核酸适体(Apt)序列[8]: HS-AAAAAAGATCGGGTGTGGGTGG CGTAAAGGGAGCATCGGACA(生工生物工程(上海)股份有限公司); 赭曲霉毒素A(OTA)、 赭曲霉毒素B(OTB)、 黄曲霉毒素B1(AFB1)、 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、 玉米赤霉烯酮(ZEN)(北京华安麦科生物技术有限公司); 葡萄糖、 乙二胺、 磷酸二氢钠、 磷酸氢二钾、 三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 其他试剂均为分析纯。 实验用水为二次蒸馏水。

金纳米粒子按文献[8]制备, 其浓度浓度按文献[13]方法测定为2.7 nmol· L-1。

RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津公司)。

1.2 方法

1.2.1 N-CQDs制备

氨基碳量子点按文献[6]方法并略做适当修改合成, 即取0.25 mol· L-1柠檬酸25 mL 置于水热反应釜中, 在200 ℃ 下反应5 h, 离心、 取离心液15 mL置于50 mL圆底烧瓶中, 再加入1.2 mL乙二胺, 超声5 min, 然后在200 ℃下恒温反应5 h, 冷却至室温, 过滤, 即得到氨基修饰的碳量子点(N-CQDs), 按柠檬酸(碳源)计, 浓度为18 mg· mL-1。

1.2.2 核酸适体传感体系构建

巯基修饰的核酸适体在金纳米粒子进行表面自组装按文献[14]方法进行。 取0.52 μ mol· L-1巯基修饰的Apt与2.60 μ mol· L-1 TCEP混合均匀, 反应1 h后, 加入2.6 nmol· L-1 AuNPs, 混匀, 再加入pH 5.0 的500 mmol· L-1酒石酸-HCl缓冲溶液, 孵化30 min, 转至12 000 r· min-1离心20 min, 弃去离心液, 再用pH 7.5的10 mmol· L-1 PBS溶液冲洗, 离心并弃去离心液, 如此三次, 制得AuNPs/Apt, 将其分散于水中, 4 ℃下储存备用。

将AuNPs/Apt与一定比例N-CQDs在磷酸缓冲溶液(phosphate buffer sdution, PBS)(pH 7.5, 10 mmol· L-1)溶液中混匀, N-CQDs在AuNPs/Apt表面组装, 即得核酸适体传感敏感体系。

1.2.3 OTA分析程序

取核酸适体传感体系溶液200 μ L, 加入不同浓度的OTA(0~2.0 ng· mL-1)标准溶液10 μ L, 加入PBS溶液290 μ L调节至孵化6 min, 测其溶液的荧光强度, 记为F。 以F-F0对OTA浓度作图, 得到F-F0与OTA浓度的关系, 进而进行OTA测定。 取传感体系溶液, 分别依次真菌毒素(OTA, AFB1, DON, OTB和ZEN), 用PBS溶液稀释, 孵化, 进行特异性试验。 光谱测定均在室温下pH 7.5 PBS 溶液中进行。

1.2.4 啤酒中OTA分析

取啤酒样品50 mL, 超声10 min去除气泡, 准确量取2.0 mL啤酒置于5.0 mL容量瓶中, 用PBS溶液(pH 7.5)稀释至刻度, 摇匀, 即得啤酒试样溶液备用。

取啤酒试样溶液10 μ L, 核酸适体传感体系溶液200 μ L, PBS溶液290 μ L摇匀, 孵化6 min后, 测定其荧光强度, 确定啤酒中OTA含量。

2 结果与讨论
2.1 方法原理

AuNPs具有强烈的荧光猝灭功能[15]。 在传感体系中, AuNPs/Apt/N-CQDs荧光猝灭; 向传感体系溶液中加入OTA时, 复合物中Apt与OTA反应特异性生成Apt-OTA复合物并释放出N-CQDs, 体系荧光恢复。 根据OTA的浓度与体系的荧光恢复程度之间的关系, 测定啤酒中OTA残留量, 其原理如图1所示。

图1 (a) N-碳量子点的荧光激发和发射 光谱和(b)核酸适体荧光传感原理Fig.1 (a) Exiting and emission fluorescence spectra of N-Carbon quantum dots and (b) the mechanical of fluorescence quenched and recovered of the aptasensors

2.2 核酸适体用量的影响

研究了Apt与AuNPs的摩尔比对N-CQDs荧光猝灭的影响, 结果见图2。 Apt为AuNPs的100~220倍时, 荧光猝灭随Apt的增大而增强, 200倍时荧光最强, 然后随Apt用量增大而减弱。 向荧光猝灭了的体系中加入OTA, 体系荧光恢复变化情况与猝灭情况类似, 100~200倍范围, 随Apt的增大, 荧光恢复程度增强, 200倍时达到最大值, 随后又降低。 基于Apt用量是AuNPs 200倍时, 体系的荧光猝灭和恢复都达到最大, 故在后续试验中, 控制Apt的用量为AuNPs 200倍。

图2 核酸适体与金纳米粒子摩尔用量比对体系荧光猝灭的影响Fig.2 Influence of the molar ratio between aptamer and Au nanoparticles on fluorescence quenched of the system

2.3 pH的影响

图3是体系荧光强度随pH影响曲线。 pH 5.0~7.0时, 荧光强度随pH升高而显著增强, 到pH 7.5时达到最大值, 之后随pH的增大而逐渐降低, 当大于pH 9.0时显著下降。 这主要是N-CQDs对H+离子敏感。 在酸性条件下, 量子点表面氨基接受质子, 引起荧光猝灭; 碱性条件下, 量子点表面氨基形成氢键团聚, 也引起荧光猝灭。 pH 7.0时有最大荧光恢复, 故后续试验在pH 7.5缓冲溶液中进行。

图3 pH对体系荧光强度的影响Fig.3 Influence of pH on fluorescence intensity of the system

2.4 孵化时间的影响

在室温下, 考察了孵化时间对荧光恢复的影响。 结果如图4所示。

图4 孵化时间对体系荧光的影响Fig.4 Influence of incubation time on fluorescence intensity of the system

从图4可见, 孵化时间5 min, 体系荧光迅速恢复; 继续延迟孵化时间, 体系荧光强度不再变化, 且稳定1 h, 故选孵化时间为6 min。 说明OTA迅速与复合物中Apt结合并释放出N-CQDs。 因此, 可以实现样品中OTA的快速测定。

NaCl用量试验表明, 其浓度小于50 mmol· L-1时, 对体系荧光强度变化无明显影响。

2.5 传感方法的特异性

图5是传感体系特异性试验结果。 该核酸适体传感对OTA呈现高特异性, 其他真菌毒素对OTA测定无明显干扰。

图5 核酸适体传感分析的选择性, OTA为1.0 ng· mL-1, 其余真菌毒素浓度为10 ng· mL-1Fig.5 Selectivity of the aptasensor assay, concentration of OTA: 1.0 ng· mL-1, others: 10.0 ng· mL-1

2.6 工作曲线

取AuNPs/Apt/N-CQDs分散液适量, 用PBS溶液稀释至2 mL, 测定体系的荧光强度, 记为F0; 再加入不同浓度的OTA标准溶液, 孵化6 min, 测定其荧光, 记为F; 体系荧光恢复程度为F-F0。 试验结果如图6所示, 体系的荧光强度随着OTA的浓度增大而增强; 体系的荧光恢复程度F-F0与OTA浓度在0.003~0.80 ng· mL-1范围内呈现出良好的线性关系, 其线性回归方程为F-F0=6.499+211.6 c(c为OTA的浓度, 单位: ng· mL-1), 相关系数r为0.995 5, 方法检出限(3σ /k)为3 pg· mL-1。

图6 体系的荧光强度随OTA浓度(0, 0.005, 0.010, 0.025, 0.050, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.60, 0.80和1.0 ng· mL-1)的变化情况; 插图: F-F0与OTA的浓度在0.005~1.0 ng· mL-1范围内呈良好的线性关系Fig.6 The dependence of FL intensity on the concentration of OTA(0, 0.005, 0.010, 0.025, 0.050, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.60, 0.08 and 1.0 ng· mL-1); Inset shows the linear relationship between the F-F0 and OTA concentration within the range of 0.005~1.0 ng· mL-1

2.7 啤酒中OTA测定

用所建立的核酸适体传感方法, 对市售啤酒中的 OTA 检测, 结果如表1所示。

表1 啤酒样品中OTA的检测结果 Table 1 Detection of OTA in Beers samples (n=3)

在所测13个啤酒样品中, 有6个检测到OTA。 受到OTA污染的啤酒样品OTA浓度范围为0.008~0.63 ng· mL-1, 检测结果见表1。 在啤酒样品中的回收率在93.3%~108.9%, 标准偏差小于5.0, 表明该传感体系能适用于啤酒中残留OTA检测。

3 结 论

应用N-CQDs在AuNPs/Apt/N-CQDs复合物中荧光猝灭, OTA与AuNPs/Apt/N-CQDs复合物中Apt结合释放出N-CQDs而荧光恢复的特性, 建立了核酸适体荧光传感快速检测啤酒中赭曲霉毒素A的新方法。 与传统方法比较, 该法具有选择性高、 方法简单、 灵敏、 快速、 无需样品处理等优点。 在13个市售啤酒样品中, 6个啤酒样品中存在不同程度的OTA污染, 其中, OTA残留量最高的为0.63 ng· mL-1, 未超过国家标准允许范围。 方法回收率为93.3%~108.9%。 标准偏差小于5.0, 适合于啤酒样品中OTA分析。

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