黑土肥力长期定位监测试验站1979年建立, 现位于中国黑龙江省哈尔滨市民主乡光明村(E126° 51' 28″, N45° 50'37″), 海拔151 m, 属松花江二级阶地。 土壤为发育于黄土状母质上的中层黑土, 黑土层厚度为50 cm, 质地为壤质, 土壤粘粒含量为30%35%。 气候属中温带大陆性季风气候, ≥ 10 ℃年平均有效积温为2 700 ℃, 年降雨量为533 mm, 无霜期为135 d。 试验设24个处理, 3次重复, 每个小区面积为36 m², 定位试验之前种植作物为小麦(1979年), 长期定位试验采用小麦(1980年)— 大豆— 玉米轮作方式。 初始耕层(1979年, 020 cm)土壤基本性质为: 有机碳含量为15.5 g· kg^-1, 全氮含量为1.47 g· kg^-1, 全磷(P₂O₅)含量为1.07 g· kg^-1, 全钾(K₂O)含量为25.16 g· kg^-1, 碱解氮含量为151 mg· kg^-1, 有效磷含量为51 mg· kg^-1, 速效钾含量为200 mg· kg^-1, pH值为7.2。 在不同作物施肥用量见表1, 有机肥为纯马粪, 采集于固定养马农户, 按纯氮量75 kg· hm^-2(约马粪18 600 kg· hm^-2)施用, 每轮作周期玉米收获后施入。 马粪中有机碳(C)、 氮(N)、 磷(P₂O₅)和钾(K₂O)含量分别为163.6, 5.8, 6.5和9.0 g· kg^-1。 氮、 磷、 钾肥均为秋季施肥(玉米季氮肥50%秋施, 50%于大喇叭口期追肥), 氮肥为尿素(N 46%), 磷肥为重过磷酸钙(P₂O₅ 46%), 钾肥为硫酸钾(K₂O 50%)^[8]。 2012年M和MNPK处理玉米产量为7 200和9 869 kg· hm^-2, CK处理产量为4 459 kg· hm^-2。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 长期定位试验施肥处理及施肥量(1979年— 2018年) Table 1 Treatment and fertilizer application rates of long-term experiment(1979— 2018 year) 处理 施氮量N/(kg· hm-2) 施磷量P2O5/(kg· hm-2) 施钾量K2O /(kg· hm-2) 有机肥 /(t· hm-2) 小麦 大豆 玉米 小麦 大豆 玉米 CK 0 0 0 0 0 0 0 0 M 0 0 0 0 0 0 0 18.6 MNPK 150 75 150 75 150 75 75 18.6

表1 长期定位试验施肥处理及施肥量(1979年— 2018年) Table 1 Treatment and fertilizer application rates of long-term experiment(1979— 2018 year)

本试验选取长期定位试验对照不施肥(CK), 有机肥(M), 有机肥与无机肥氮磷钾配施(MNPK)。 土壤样品采集于2012年秋(玉米), 采用S型取样, 共取5点, 采集深度为0~20 cm。

1.3.1 胡敏酸(HA)的分离纯化

称取过2 mm筛的风干土样100 g加入玻璃瓶中, 按土水比1∶ 1加入1 mol· L^-1的HCl, 放置1 h, 之后用0.1 mol· L^-1的HCl调至最终土水比1∶ 10, 室温摇动玻璃瓶1 h, 将混合液低速离心, 弃去上清液。 用1 mol· L^-1的NaOH中和离心后沉淀(pH 7), 放置1 h, 再用0.1 mol· L^-1的NaOH调至最终土水比1∶ 10, 立即充氮气(1 min)并盖严。 保持氮气条件下(盖严)摇动玻璃瓶, 频率为1次/1 h, 持续12 h后静置过夜。 翌日低速离心(3 500 r· min^-1), 用6 mol· L^-1的HCl将瓶中液体酸化至pH 1.0, 放置12~16 h。 重复提取3次, 之后低速离心, 沉淀为HA。 氮气条件用少量的0.1 mol· L^-1的KOH溶液溶解HA, 之后加入固体KCl, 使K⁺浓度为0.3 mol· L^-1, 静置1 h后, 高速离心并保留上清液。 用6 mol· L^-1的HCl调节上清液至pH 1.0, 放置12~16 h, 高速离心后弃掉上清液。 用0.1 mol· L^-1 HCl+0.3 mol· L^-1 HF混合酸浸泡HA, 洗至灰分含量小于1%。 之后放入电渗析室里电渗, 直到用AgNO₃检测蒸馏水中无Cl^-, 把液体旋转蒸发浓缩, 冻干备用^[9]。

1.3.2 测定方法

(1) 热性质分析

热性质分析采用日本岛津TA-60型差热分析仪测定, 并应用仪器自带软件对各样品进行差热分析(differential thermal analysis, DTA)和热重分析(thermogravimetric analysis, TG或TGA)^[9]。

(2)红外光谱(FTIR)分析

红外光谱(IR)分析应用美国NICOLET-EZ360红外光谱仪, 扫描模式为4 000~400 cm^-1, 采用KBr压片法测定。 将待测有机质样品经真空冷冻干燥后, 粉碎研细到小于2 μ m, 然后分别用微量或半微量天平称取土壤有机质样品和KBr粉末, 并以样品∶ KBr=1∶ 200的比例, 在玛瑙研钵中混磨后压片。 以4 000, 2 000和860 cm^-1处作为零吸收点, 将通过3点的直线作为基线, 进行吸收强度的测定, 并加以比较。 测定时, 仪器的分辨率设为4 cm^{-1 [10]}。

(3) 核磁共振波谱(CPMAS ¹³C-NMR)分析

采用固态¹³C核磁共振波谱用瑞士BrukerAV400型核磁共振仪测定, 运用交叉极化魔角自旋(CPMAS)技术, ¹³C共振频率为400.18 MHz, 魔角自旋频率为8 kHz接触时间为2 ms, 循环延迟时间为3 s, 数据点为3 000个, 化学位移用外标2, 2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸钠(DSS)校正, 积分面积由仪器自动给出, 各类型碳相对含量用某化学位移区间积分面积占总积分面积的百分数表示^[11]。

(4)荧光光谱分析

荧光谱测定采用仪器为Perkin Elmer Luminescence Spectrometer LS50B。 激发光源: 150 W氙弧灯; PMT电压: 700 V; 信噪比> 110; 带通(Bandpass): Ex=10 nm; Em=10 nm; 响应时间: 自动; 扫描速度: 1 500 nm· min^-1; 扫描光谱进行仪器自动校正。 样品扫描浓度均为25 mg(C)· L^-1, 运用该产品自带的软件(FL WinLab software (Perkin Elmer))收集数据。 三维荧光光谱测定时发射光谱波长Em=250~700 nm。

(5)数据统计分析

红外光谱分析采用Nicolet Omnic8.0专业软件分析, 核磁共振波谱(CPMAS ¹³C-NMR)采用MestReNova专业软件分析, 荧光光谱运用该产品自带的软件(FL WinLab software (Perkin Elmer))收集数据。 经过分析提取源数据后采用Microsoft Office Excel 2010和Origin 8.0软件进行数据处理和绘图, Origin绘图将“ Available Data” 中数据以拟合曲线叠加方式进行绘制, SPSS 19.0统计分析软件对数据进行差异显著性检验(邓肯法)。

本研究中M和MNPK施肥处理土壤有机碳含量为14.50和14.79 g· kg^-1, CK处理土壤有机碳含量为12.41 g· kg^-1, 土壤中施入有机肥和有机无机肥配施后较不施肥土壤有机碳平均增加了16.8%和19.2%。 M和MNPK施肥处理的土壤HA含量为4.43和5.03 g· kg^-1, 较CK土壤HA含量提高53.8%和74.7%。 表明M和MNPK施肥处理可以明显提高土壤有机碳和HA含量(p< 0.05), 差异显著, 并且MNPK施肥处理提高幅度高于M施肥处理。

图1

Fig.1

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	图1 有机培肥后黑土有机碳和HA的含量Fig.1 Content of organic carbon and HA in black soil after organic-inorganic fertilizer application

样品和参比物之间的温差是由于样品在程序升温过程中放出或吸收热量造成的(参比物不放热或吸热)。 这种热量的形成是由样品发生相变或反应热效应引起的, 如熔化、 沸腾、 升华、 蒸发、 氧化-还原反应、 脱氢反应、 晶格结构破坏以及其他化学反应等^[12]。 土壤HA的差热分析DTA曲线显示(图2): M和MNPK施肥处理和CK都出现低温吸热峰, 中温和高温放热峰。 低温吸热峰峰温M和MNPK施肥处理出现在70 ℃, CK处理在75 ℃左右; 中温放热峰都在340 ℃左右; 高峰放热峰M和MNPK施肥处理为520和510 ℃, 而CK处理为515 ℃。 从半定量积分数据的结果来看, M和MNPK施肥处理土壤腐殖质HA反应热与CK存在一定的差异。 M和MNPK施肥处理HA总反应热(吸热+放热)为11.71和12.18 kJ· g^-1, CK处理HA总反应热为10.17 kJ· g^-1, 有机培肥处理的HA总反应热较CK高可以初步说明处理中能够分解的有机质含量较高, 并且MNPK的HA总反应热的值高于M施肥处理。 M和MNPK施肥处理土壤HA中温放热值高于CK处理, 分别为1.63和1.73 kJ· g^-1较CK提高15.6%和22.7%; CK和M, MNPK施肥处理土壤HA的高温/中温比值为6.68和6.55和6.43。 中温值较高可以说明有机培肥处理脂族结构和外围羧基官能团所占比例升高, 并且MNPK施肥处理中温值高于M施肥处理, 表明有机无机肥配施更能增加土壤HA脂族结构。 而CK处理土壤HA的高温/中温比值较高说明其分子中芳香结构相对较多。

图2

Fig.2

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	图2 有机培肥后黑土HA的DTA曲线特征Fig.2 DTA curve characteristics of HA in black soil after application of organic and inorganic fertilizer

研究认为2 920, 2 850和1 460~1 450 cm^-1吸收峰应归属于脂族C— H的伸缩振动, 三个峰的强度可表征腐殖质(HS)中脂族化合物的含量, 2 920/2 850值可理解为脂族链烃中聚亚甲基碳和末端甲基碳的比例, 即n值, 反映脂族链的长短或分支情况, 特征峰的吸收强度的多少可反映官能团量的相对多少^[13]。

从图3可看出: M, MNPK和CK处理土壤HA的IR图谱具有相似的特征, 在3 400, 2 920, 2 850, 1 720, 1 620和1 240 cm^-1处均有吸收峰, 但吸收强度不同。 黑土中腐殖质组分HA在2 920 cm^-1(脂族聚亚甲基)和1 620 cm^-1(芳香类)振动最为强烈, M, MNPK施肥处理3 400 cm^-1附近具有较强吸收峰(羟基官能团)。 从表2可看到: 2 920, 2 850, 1 720, 1 620, 1 240 cm^-1处吸收峰的积分面积均为M, MNPK施肥处理高于CK。 各吸收峰的积分面积的不同, 导致其比值发生变化。 不同施肥处理黑土HA的IR吸收峰2 920/1 720值M> MNPK> CK, 有机培肥处理与CK处理之间差异显著(p< 0.05)。 2 920/1 620值为MNPK施肥处理较高, M施肥处理较低。 同样, MNPK施肥处理的HA的IR吸收峰2 920/2 850值高于其他处理, MNPK施肥处理最高, 其比值为5.908, 而M施肥处理土壤HA的2 920/2 850值较CK下降。

图3

Fig.3

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	图3 有机培肥后黑土HA的IR图谱特征Fig.3 IR spectra of black soil after organic-inorganic fertilizer application

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同施肥处理黑土HA的IR光谱主要吸收峰的相对强度/cm-1(半定量) Table 2 The relative intensities of the main absorption peak of HA IR spectrum in different fertilization treatments of Black soil (semi-quantitaty, cm-1) 处理 CK M MNPK 2 920 0.905± 0.01b 2.059± 0.04b 2.180± 0.03a 2 850 0.310± 0.01a 1.077± 0.08a 0.369± 0.01a 1 720 1.112± 0.01b 2.304± 0.05a 2.032± 0.01a 1 620 0.888± 0.01b 3.033± 0.01a 1.622± 0.03a 2 920/1 720 1.093± 0.01b 1.361± 0.08a 1.254± 0.02a 2 920/1 620 1.368 ± 0.01b 1.034± 0.03c 1.572± 0.03a 2 920/2 850 2.919 ± 0.10b 1.912± 0.14c 5.908± 0.06a Note: 2 920/1 720 means the ratio of the area of 2 920+2 850 to the area of 1 720; 2 920/1 620 ratio is the ratio of the area of 2 920+2 850 to the area of 1 620; 2 920/2 850 ratio is the ratio of the area of 2 920 to the area of 2 850 注: 2 920/1 720比值为2 920+2 850处面积与1 720处面积的比值; 2 920/1 620比值为2 920+2 850处面积与1 620处面积的比值; 2 920/2 850比值为2 920处面积与2 850处面积的比值

表2 不同施肥处理黑土HA的IR光谱主要吸收峰的相对强度/cm-1(半定量) Table 2 The relative intensities of the main absorption peak of HA IR spectrum in different fertilization treatments of Black soil (semi-quantitaty, cm-1)

腐殖质的¹³C核磁共振波谱图中碳谱可划分为4个主要的共振区, 即烷基C区(0~50 mg· L^-1)、 烷氧C区(50~110 mg· L^-1)、 芳香C区(110~160 mg· L^-1)和羰基C区(160~200 mg· L^-1)^[14]。 一般各共振区的烷基C区主要吸收峰及归属在21, 26, 30, 33和44 mg· L^-1观察到吸收峰, 它们分别为芳环相连的CH₃, CH₂, 无定型(CH₂)n长链C, 晶型(CH₂)n长链C和支链烷基C^[15]。 本研究中土壤HA的烷基C吸收峰主要在30 mg· L^-1附近, 是长链烷烃或环烷烃结构中的亚甲基C的化学位移。 烷氧C区中, 54~55 mg· L^-1为甲氧基C的吸收, 61~62, 72~75和83~87 mg· L^-1为碳水化合物C的吸收, 103~105 mg· L^-1为双烷氧C的吸收, 图4所示, 施肥处理中黑土HA的烷氧C吸收峰主要在55 mg· L^-1附近, 归属为甲氧基C的吸收和碳水化合物C的吸收。 芳香C区中, 129 mg· L^-1附近主要是被羧基或羧甲基取代的芳香C以及与O, N等取代基间位的连H芳香C的吸收; 羰基C区中, 主要信号出现在170 mg· L^-1附近, 为羧酸、 酯和酰胺C的吸收^[11]。 烷基C和烷氧C构成腐殖质的脂族C, 芳香C主要是木质素C, 代表其芳香性, 值越高表明结构越复杂。

图4

Fig.4

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	图4 有机培肥后黑土HA的CPMAS13C-NMR波谱特征Fig.4 CPMAS13C-NMR spectrum characteristics of HA in black soil after application of organic and inorganic fertilizer

M, MNPK施肥处理土壤HA中烷基C的比例为21.1%和21.8%, 烷氧C为18.6%和16.2%, 芳香C为42.4%和42.1%, 羰基C为17.8%和19.9%; 烷基C和烷氧C之和脂族C为39.7%和38.0%。 CK处理黑土HA中烷基C的比例为19.1%, 烷氧C为18.4%, 芳香C在44.3%, 羰基C为18.3%; 脂族C为37.5%。 本研究中M, MNPK施肥处理土壤HA的脂族C较CK增加, 芳香C含量下降, MNPK施肥处理HA的羰基C较CK增加, 而M施肥处理较CK降低。

如图5, 不同的施肥处理均在Ex/Em=460470/518530 nm和330340/478520 nm产生两个特征峰。 通过分析可知, a峰属于紫外区类富里酸荧光峰, c峰可归结为类胡敏酸荧光峰。 在各处理胡敏酸的三维图谱中, 未观测出类蛋白荧光峰及可见区类富里酸峰。 在已观测到的两个荧光峰中, 类胡敏酸峰的荧光峰值要大于紫外区类富里酸峰, 且这两个特征峰的相对波长都较长, 表明其分子量相对较高, 并且含有线性稠环、 芳香环以及一些具有不饱和结构的基团, 如羰基、 羧基等。 荧光指数(fluorescence index, f_450/500)是激发光波长370 nm时, 荧光发射光谱中450和500 nm处荧光强度比值。 f_450/500值与HA芳香性之间呈负相关。 f_450/500值较高说明其腐殖类物质含有较少的苯环结构, 芳香性较弱^[16]。 在本试验中胡敏酸的分子结构均较为复杂。 CK, M, MNPK处理HA的f_450/500值分别为0.583, 0.601, 0.618。 研究显示, 类胡敏酸荧光峰的存在是腐殖酸分子结构复杂、 腐殖化程度高的表现, 而类富里酸荧光峰与腐殖质结构汇总羰基和羧基的形成有关。 当腐殖质形成宽且强度较弱的峰时, 其芳化程度较高, 不饱和键多, 亲电子官能团也较多; 当图像结果相反时, 腐殖质的芳化度低、 不饱和键较少, 亲电子官能团少, 结构也相应简单。 施入有机物料后, 土壤HA的370450 nm波长发生紫移, 即向波长减少的方向移动, 表明HA的芳构化程度下降, 以结构较简单的、 增强分子荧光强度的取代基— OH, — NH₂等取代较为复杂的、 能使荧光强度减弱的取代基— CO₂H, — C=O, 并且降低分子芳化程度与缩合度, 使分子结构简单化。 因此可推断本研究中MNPK, M施肥处理HA含有苯环结构较少, 结构趋于简单化, 而CK处理芳构化程度较强, 结构较为复杂。

图5

Fig.5

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	图5 有机培肥后黑土HA的荧光三维光谱特征Fig.5 The three dimensional fluorescence characteristics of HA in black soil with organic and inorganic fertilizer