选取了四种典型细菌类生物战剂模拟物和两种毒素类生物战剂模拟物, 其中, 细菌类模拟物为成团泛菌、 金黄色葡萄球菌金黄亚种Staphylococcus aureus subsp. Aureus(Sta)、 大肠杆菌(大肠埃希氏菌)和球芽孢杆菌, 毒素类模拟物为牛血清BSA和卵清蛋白OVA。 BSA和OVA均来自Sigma Aldrich, 成团泛菌、 金黄色葡萄球菌金黄亚种、 大肠杆菌(大肠埃希氏菌)和球(芽孢)杆菌均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 编号分别为CGMCC 1.4006, CGMCC 1.128, CGMCC 1.2812和CGMCC 1.1202。

用浸过75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管, 在超净台(名牌之星, 型号SW-CJ-1D)无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖, 取约1 mL复溶液, 加入到冷冻管中, 轻轻振荡, 使冻干菌株溶解呈悬浮状。 用无菌吸管吸取菌悬液, 转移到复溶液滴瓶中。 做好标识, 在HNY-2102C立式恒温振荡培养箱(天津欧诺)中适宜温度下培养。 成团泛菌和大肠杆菌的培养基为LB培养基, 金黄色葡萄球菌和球芽孢杆菌的培养基为TSB培养基, 配制好后用高压蒸汽灭菌17 min。 TSB, LB培养基的pH测定和调节由pH计(Sartorius, 型号PB-10)完成。 成团泛菌和球芽孢杆菌的培养温度为30 ℃, 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养温度为37 ℃。

荧光物质在紫外激光的激励下, 会辐射出宽谱荧光, 不便于类型的识别。 为提高类型辨识能力, 激光器输出的3倍频355 nm、 4倍频266 nm波长激光, 分别用于氨基酸荧光分子、 NADH和维生素B荧光的荧光和偏振测量, 355和266 nm两个波长的激光能量脉宽均为5 ns, 脉冲能量约为5 mJ, 重复频率为10 Hz。 荧光信号由400 mm口径的牛顿型望远镜收集, 并由光谱仪进行分析, 其分辩率为2/4 nm。 荧光的探测范围为250650 nm, 探测距离不小于20 m。 图1为近场激光雷达的荧光测量原理图。

图1

Fig.1

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	图1 近场激光雷达荧光测量示意图Fig.1 Schema of short range LIF lidar setup

在振荡培养箱里, 对成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌和大肠杆菌等四种典型细菌类生物战剂模拟物进行了28 h的平行培养。 然后, 在超净台中按无菌操作进行菌液准备, 即取已经划过线的固体培养基, 用无菌牙签沾取少量的菌体置于含有约50 mL的液体TSB或LB培养液中, 放置于30 ℃/37 ℃恒温振荡培养箱内, 每隔2H分别吸取成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌和大肠杆菌营养肉汤培养液1 mL, 并用10 mL 0.9%无菌氯化钠溶液稀释成菌悬液, 用UV1102紫外可见分光光度计测定四种菌液在600 nm波长上的吸光度, 用0.9%无菌氯化钠溶液作为空白参比, 记录四种菌液的吸光度值OD。 OD测量均重复三次, 直至菌液OD值达到平稳状态。

从细菌复活后的芽孢态开始, 分别对各菌不同生长时期的吸光度值进行了三次重复测定, 得到了各菌的生长曲线。 由图2可知,

(1)在设定的培养条件下, 四种菌的生长阶段较为明显, 主要有萌发期、 对数生长期、 平稳期和衰亡期。 其中, 球芽孢杆菌和成团泛菌两种菌的萌发期较短, 可能是菌种培养环境与现有培养环境相近, 在培养初期溶氧和酸碱度都较为适宜, 菌种极快地适应了新环境并对数生长; 球芽孢杆菌和成团泛菌的对数生长期持续约4 h, 从第4小时后到第24小时结束为过渡平稳期, 之后进入稳定平稳期。 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的萌发期相对较长, 约为15小时和6小时; 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的对数生长期分别为2和6 h。 成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌和大肠杆菌的代时分别为0.99, 0.835, 1.07和1.909 h。

(2)只有大肠杆菌有明显的衰亡期, 在约5 h的平衡期后, 大肠杆菌进行营养和空间的竞争, 有些大肠杆菌死亡, 吸收率随即开始衰减, 其整个生命周期呈“ J” 型; 说明细菌的培养生长曲线受遗传性、 接种量和培养条件等因素的影响, 会有所变化。

图2

Fig.2

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	图2 四种典型细菌类生物战剂模拟物生长曲线Fig.2 Growth curve of 4 typical bioagents simulants

BSA和OVA气溶胶配制: 在超净台用去离子水ddH₂O稀释, 得到的溶液浓度约为1.0× 10⁶和5.0× 10⁶ 个· mL^-1, 摇匀后4 ℃静置10 min, 荧光待测。

成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌营养态细菌气溶胶配制: 在超净台分别汲取过夜培养(约24 h)后的Pan, Sta和BG菌液5 mL, 注入15 mL生理盐水的离心管中, 在7 500 r· min^-1转速下离心10 min两次, 去掉上清液, 再分别加入10 mL生理盐水, 摇匀后4 ℃静置10 min, 荧光待测。

大肠杆菌营养态细菌气溶胶配制: 在超净台分别汲取15 h培养后的菌液5 mL, 注入15 mL生理盐水的离心管中, 在7 500 r· min^-1转速下离心10 min两次, 去掉上清液, 再分别加入10 mL生理盐水, 摇匀后4 ℃静置10 min, 荧光待测。

荧光测量在距离激光雷达约20 m的喷雾型测量腔中进行。 气溶胶室长15 m, 尺度为2.0 m× 2.0 m。 两端配有活动门, 挂起时可以关闭, 放下时打开。 测量方法: (1)室门关闭, 将选定的BSA、 OVA、 成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌和大肠杆菌营养态气溶胶, 在数秒时间内利用气流式雾化器和风扇, 充分混合均匀, 并保留10 s以确保室内具有良好的各向同质性; (2)然后打开腔前门, 用激光雷达完成荧光测量; (3)激光雷达数据采集结束后, 打开后门, 在数分钟内清空测量腔中的气溶胶; (4)测量腔中气溶胶清空并紫外线灭菌后分别测量同等浓度超纯水和生理盐水的荧光背景信号, 作为参比扣除。

在激光回波检测中使用的去噪方法有匹配滤波、 平滑滤波等; 当信号波形已知时, 匹配滤波方法能够有效地实现信号检测, 是输出信噪比最大化意义上的线性滤波器, 但对于非平稳的回波信号其性能会大幅下降。 尤其是, 滑动平均滤波只相当于低通滤波器, 中值滤波降噪优势是消除孤立的噪声, 当信噪比很低时, 改善信噪比性能有限^{[9, 10]}。

荧光信号较MIE散射信号低数个数量级, 为尽可能地保留信号光谱的特征, 不能采用常规的平滑降噪处理, 对激光雷达的原始PRR信号, 采用了分解级数为4的Daubechies(db4)小波基, 与滑动平均方法比较而言, 利用该小波去噪可以更好地保留了激光雷达回波信号的峰值特征。

3.4 2D荧光发射谱和二阶导数荧光发射谱

根据生长曲线, 大肠杆菌取15 h菌液, 其他三种则是24 h菌液, 在荧光测量腔中进行荧光和背景测量。 去除信号中的拉曼和瑞利散射信号后, 经归一化, 得到了如图3所示的各模拟物液态气溶胶的二维荧光发射谱。 经与色氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸的本征二维荧光谱对比分析后, 可得到以下结论:

(1)BSA, OVA以及成团泛菌、 金黄色葡萄球菌、 球芽孢杆菌和大肠杆菌营养态细菌气溶胶的二维荧光谱分布、 谱形与色氨酸一致性较高, 荧光谱的半高宽FWHM为60 nm, 说明其主要成份为色氨酸, 酪氨酸和苯丙氨酸的荧光贡献基本为0;

(2)相对于色氨酸的280/350 nm本征荧光峰, 其他所有模拟物的荧光发射中心波长均存在不程度的紫移, 其中OVA和BSA的荧光发射波长分别紫移了18和12 nm, 荧光峰位于280/332和280/338 nm; 金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、 球芽孢杆菌的荧光发射波长紫移了10, 16, 8和16 nm, 荧光峰位于280/340, 280/336, 280/342和280/334 nm;

(3)仅利用单个或数个激发波长得到的发射谱, 要区分和识别不同生物物质, 较为不易。 而将光谱进行高阶处理, 如求解二阶导数, 得到二阶导数谱, 以将光谱曲线的差异放大。 对荧光光谱求二阶导数后, 光谱谱带变窄, 二阶导数光谱的极小值对应荧光光谱峰值, 在定量测量上表现出很高的灵敏性^[11]。 图3(b)示出了三种液态生物气溶胶和标准荧光组分色氨酸的二阶导数谱, 可见二阶导数的最小值, 与图3(a)中的荧光峰值位置一致。 此外, 二阶求导后的谱曲线变得非常杂散, 不平滑, 这主要是由于被测物浓度低, 受背景影响较大所致。

图3

Fig.3

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	图3 BSA, OVA和典型生物战剂模拟物氨基酸段荧光光谱 (a): 原始谱; (b): 二阶导数谱Fig.3 Fluorescence spectra of BSA, OVA and typical bioagents simulants (a): Original; (b): 2nd derivative

NADH是反应细胞呼吸和新陈代谢活动的标志之一。 图4示出了经降噪平滑和归一化处理后的4种典型生物战剂模拟物和标准荧光组分NADH在NADH荧光段的荧光谱曲线, 由图4(a)可知:

(1)所有菌的荧光谱谱形与NADH标准荧光谱的谱形较为一致, FWHM约为100 nm;

(2)由于NADH组分含量低, 加之荧光效率低, 强度弱, 故除标准荧光组分NADH的谱曲线较为光滑外, 其他模拟物的荧光谱线的噪声波动较大, 荧光谱线不平滑, 在中心波长附近, 存在宽度较窄的小尖峰, 尤其是在大于中心波长450 nm的谱段, 波动较大, 毛刺严重;

(3)与氨基酸段的荧光类似, 所有营养态细菌的荧光谱较标准NADH荧光谱, 存在较为一致的紫移, 紫移了约25 nm;

(4)由于荧光信号较弱, 大肠杆菌、 球芽孢杆菌营养态模拟物的荧光谱中还存在强度约为荧光强度一半的瑞利散射信号, 强度约为荧光强度90%的387 nm氮拉曼信号和403水拉曼信号残留;

(5)与氨基酸段荧光谱类似见图4(b), 二阶导数荧光谱放大了四种营养态细菌二维荧光谱曲线的差异。

图4

Fig.4

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	图4 4种模拟物NADH段荧光光谱 (a): 原始谱; (b): 二阶导数谱Fig.4 Fluorescence spectra of typical bioagents simulants within the NADH segment (a): Original; (b): 2nd derivative