试验样本的培育在浙江大学紫金港校区试验田中进行。 将油菜种撒在大田中, 培育至约10 cm高, 选取健壮, 长势均匀的幼苗移栽至盆穴中单株培育, 待单株油菜生长出56片以上较大叶片时, 对其进行病菌接种。 由于实验中不可控因素的存在, 菌丝接种率无法达到100%, 故选取120株油菜植株叶片进行接种, 最终根据接种情况来确定试验样本数量。 将成功接种的油菜植株放入人工温室环境(温度25 ℃, 湿度85%)中静置24 h, 然后将其取出进行试验。

1.2.1 无人机低空遥感模拟平台

模拟低空遥感环境, 将热红外成像仪搭载在无人机低空遥感模拟平台进行试验, 其中无人机低空遥感模拟平台如图1所示。 该平台由系统硬件和操控系统两部分组成。 其中, 系统硬件部分是由热红外成像仪、 直线滑行导轨、 驱动装置、 三轴云台、 电动缸组件组成。 试验模拟的飞行长度为12 m, 即导轨长度; 模拟飞行高度为3.8 m。 相机传感器搭载在三轴云台上, 云台安装在导轨上, 通过操控系统控制导轨前进、 升降及云台角度转换。

图1

Fig.1

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	图1 无人机模拟平台示意图Fig.1 Schematic diagram of UVA simulation platform

1.2.2 热红外成像仪

研究中使用的热红外成像仪(FLIR-T620, FLIR Systems, Inc, USA)如图2(a)所示。 具体参数如表1所示。

图2

Fig.2

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	图2 热红外成像仪(a)和光合测量仪(b)结构示意图Fig.2 Structure diagram of Thermal imaging system (a) and Photosynthesis instrument (b)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 热红外成像仪设备参数表 Table 1 The parameters table of Thermal infrared imager equipment 参数名称 波长范围 /μ m 热灵敏度 /℃ 温度测量 精度/℃ 原始 分辨率 参数范围 7.814 < 0.04@+30 ± 2 640× 480

表1 热红外成像仪设备参数表 Table 1 The parameters table of Thermal infrared imager equipment

1.2.3 便携式光合测量仪

生理指数使用便携式光合测量仪(LI-6400, Li-COR, Inc, USA)采集, 设备如图2(b)所示。 该设备通过检测植物的生理状况, 将植物的各项生理指标(CO₂浓度、 气孔导度、 光合速率等)进行采集, 为分析各项生理活动提供数据保障。

热红外图像的采集分三次完成, 主要为接种前(健康植株), 接种24 h后(病症未显现)以及接种48 h后(病症完全显现)三个阶段。 采集时间为上午9:00— 12:00, 在实验前调整实验室温度(20± 2) ℃和湿度(50%~60%), 为试验的进行提供相对稳定的温湿度环境。 首先, 采集未接种的健康样本数据, 作为对照组。 然后, 从120株接种的样本中选取选取90株进行试验。 试验从接种菌丝24 h后开始, 此时油菜样本感染症状未完全显现, 属于早期病害识别。 此后, 间隔48 h后油菜样本染病症状开始明显显现, 再进行一次采集。

油菜样本生理指数的采集主要在下午2:00— 4:00完成, 在采集前将染病样本和健康样本搬到阳光充足的室外静置0.5 h, 采集时选择光线较明亮的区域, 保证植株正常进行光合作用。 为了保证数据的可靠性, 对健康样本尽量选取植株上宽大的叶片进行采集, 每次采集23片叶片, 然后取平均值; 对于染病样本, 选取叶片的病斑位置进行测量。

2.2.1 基于冠层尺度的数据处理

首先通过FLIR-T620软件获取原始热红外图片[如图3(a)]的温度值, 接着对热红外图像进行预处理, 采用Grab Cut算法^{[10, 11]}剔除样本周围的环境背景, 得到只有样本植株的热红外图像, 如图3(b), 然后将去处背景的热红外图片进行二值化处理, 得到如图3(c)所示的二值图; 最后根据温度值和灰度值之间存在得线性关系, 得到冠层尺度样本的实际温度值, 计算出样本的平均温度和最大温差值。 对整株油菜进行温度提取时, 由于受到叶片经脉等因素的影响使得最大温度和最小温度的误差较大, 故只采用了平均温度和最大温差值^{[12, 13, 14]}。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 热红外图像的处理过程 (a): 原始热红外图像; (b): 剔除背景热红外图像; (c): 二值化处理后的图像Fig.3 The processing of Thermal infrared image (a): Original thermal infrared; (b): Thermal infrared image after remoring the background; (c): Image after binarization processing

2.2.2 基于叶片尺度的数据处理

基于叶片尺度对病斑区域温度值进行提取, 是利用热红外成像仪自带软件FLIR Tools进行。 通过对样本病斑区域和健康区域进行框选, 可以获得该区域的最大温度值、 最小温度值和平均温度值。

2.2.1 菌核病侵染对油菜冠层的影响

菌核病对油菜植株的侵染较快, 为了保证完整的检测到菌核病对油菜侵染的全过程, 在菌丝接种24 h后开始采集油菜样本的热红外图片。 对图像进行对比分析, 结果如图4所示。 在接种菌丝24 h后, 就有高于健康区域的病斑点出现在油菜叶片上。 经过温度的分析比对, 接种一天(24 h)后病斑处的温度比健康区域温度高0.5 ℃, 而且随着病菌的侵染天数变化, 两者之间的温差逐渐扩大。 接种3 d后, 温差值显示为0.8 ℃, 第5天后, 病斑区域面积扩大, 从可见光图片可以看出病斑点完全失水干枯, 该区域与健康区域的温差值达到了1.9 ℃。 由以上推测, 菌核病对油菜叶片的侵染使得细胞坏死, 无法进行生理活动, 也就无法调动呼吸作用和蒸腾作用来调节植株温度的平衡, 从而使得染病部位中的温度逐渐升高直至与环境温度趋同。

图4

Fig.4

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	图4 不同天数油菜冠层的热红外图像和RGB图像Fig.4 Thermal infrared image and RGB image of rape canopy with different number of days

2.2.2 油菜菌核病侵染对油菜冠层温度的影响

基于冠层尺度, 对染病样本和健康样本的平均温度和最大温差值进行对比分析, 结果如图5所示。 首先来看平均温度, 从图中可以看出健康样本和染病样本平均温度值有差异, 且随着染病天数的增加, 差值在逐渐变大, 三次差值分别为0.59, 0.97及1.46 ℃。 然后, 从最大温差值分析, 健康样本和染病样本的差值在染病24 h后就表现得较为明显, 而且随着病菌侵染的加重, 差值较大的趋势依旧保持, 分别为2.11, 2.73及2.79 ℃。

图5

Fig.5

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图5 染病后连续3 d油菜冠层的温度分析 (a): 平均温度; (b): 最大温差* 表示染病样本的平均温度和最大温差与健康样本之间在0.05水平上显著相关; * * 表示染病样本的平均温度和最大温差与健康样本在0.01水平上显著相关Fig.5 Temperature analysis of rape canpoy for 3 consecutive days after infection (a): Average temperature; (b): Maximum temperature difference* : It means temperature and maximum temperature different of infected samples were significantly correlated with healthy samples at the level of 0.05; * * : It means temperature and maximum temperature different of infected samples were significantly correlated with healthy samples at the level of 0.01

对样本进一步采用单因素方差分析, 以验证不同样本之间的差异。 从结果可知, 染病样本和健康样本的平均温度在病菌侵染第1天后和第3天后无显著性差异, 只在病菌侵染第5天出现; 染病样本和健康样本在病菌侵染第1天即表现出显著性差异。 故对比可知, 通过分析最大温差值可以做到在病菌侵染早期实现染病样本和健康样本的区分, 是研究油菜菌核病很好地指标。

2.2.3 油菜菌核病侵染对油菜生理指数的影响

从植物生长原理来分析, 病菌对植株的侵染会使得细胞气孔的开闭失调, 进而导致植物的蒸腾作用、 呼吸作用、 光合作用等生理状态减缓和加快, 使叶片的温度调节能力降低, 致使温度不可避免的升高或降低^[15]。 病菌侵染对植株的气孔开闭、 蒸腾作用、 呼吸作用及光合作用造成的影响, 主要通过气孔导度、 光合速率、 二氧化碳浓度以及蒸腾速率来表征。

(1)油菜生理指数与染病天数之间的关系

对以上四个指数进行分析, 来判断染病样本和健康样本的生理状态差异, 结果如图6所示。

图6

Fig.6

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	图6 生理指数与染病天数之间的关系 (a): 气孔导度; (b): 光合速率; (c): 二氧化碳浓度; (d): 蒸腾速率Fig.6 The relationship between the physiological index and inoculated days (a): Stomalal conductance; (b): Photosynthetic rate; (c): Concentrations of carbon dioxide; (d): Transpiration rate

从结果可知, 从病菌侵染第1天到第5天, 染病样本的四个生理指数(气孔导度、 光合速率、 CO₂浓度以及蒸腾速率)明显低于健康样本, 这表明病菌侵染油菜样本使得其生理活动减弱, 导致生理指数相较于健康样本下降。 其中, 从染病植株的气孔导度来看, 随着染病天数的变化, 气孔导度值呈现递减的趋势。 分析光合速率可知, 随天数变化健康样本的光合速率变化较稳定, 染病植株的光合速率呈递减的趋势。 从二氧化碳浓度的分析结果可知, 染病样本和健康样本的该指数在不同天数并未发生明显变化, 由此推测病菌侵染对呼吸作用的影响不明显。 从蒸腾速率分析可知, 染病样本和健康样本之间存在较大差异。

(2)油菜生理指数与温度之间的相关性研究

由以上结果得到结论, 健康样本和染病样本可以通过生理指数进行有效区分。 这说明病菌的侵染对植株的生理活动有影响, 也从侧面表现了生理指数与叶片的温度存在着一定的相关性, 故将生理指数与样本温度建立线性相关性分析, 得到结果如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 油菜的生理指数与温度之间的相关性分析 Table 2 The correlation analysis between temperature and physical index 生理指数 气孔导度 光合速率 二氧化碳浓度 蒸腾速率 染病1天 0.184 0.623* * 0.662* * 0.338 染病3天 0.269 0.343 -0.451* -0.393* 染病5天 0.345 0.590* * 0.533* * -0.549* * 注: * 表示生理指数与温度之间在0.05水平上有相关性, * * 表示生理指数与温度之间在0.01水平上有相关性

表2 油菜的生理指数与温度之间的相关性分析 Table 2 The correlation analysis between temperature and physical index

从结果可知, 二氧化碳浓度与温度值之间在三次测量中均存在显著性差异, 气孔导度与温度值之间不存在显著性差异。 此外, 除第3天外, 光合速率与温度之间在其他两天均存在显著性差异。 蒸腾作用与光合速率类型, 与温度值之间显著性差异在后两次试验中显现。 由结果分析其中原因可知, 蒸腾作用和呼吸作用的改变会直接影响叶片温度, 而两者的改变主要通过气孔导度的开闭来调节, 所以气孔导度间接影响叶片的温度值。 光合作用主要通过蒸腾作用传输营养物质, 不直接对叶片温度值起作用。 综上分析, 光合速率、 二氧化碳浓度与蒸腾速率与样本的温度值存在相关性, 对于油菜菌核病的侵染具有重要的研究意义。

2.3.1 菌核病侵染对油菜叶片的影响

从图7的热红外图片及可见光图片对比分析看出, 随着叶片病斑状态的不断变化, 可以清晰的看出随着天数的增加, 菌核病对油菜叶片侵染过程。 从健康叶片热红外图像来看, 除叶片的经脉外, 在叶片上并未出现明显的温度差异点。 但菌丝接种24 h后, 从热图中可以清晰的观察到小面积的病斑点显现。 随着侵染天数的变化, 热红外图像中呈现出的病斑面积逐渐变大, 到第5天后, 病斑已经导致整个叶片枯黄、 失水。 从RGB图像中来看, 染病24 h后, 肉眼无法清晰直观的识别出病斑点, 直到第3天才达到肉眼清晰可见。 所以, 对油菜样本病症的观测, 热红外图像在油菜菌核病病症识别上明显早于RGB图像。

图7

Fig.7

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	图7 油菜叶片不同天数的RGB图像及热红外图像Fig.7 RGB image and thermal infrared images of rape leaf with different number of days

为了更直观的展现菌核病侵染对叶片温度值的影响, 对单一叶片进行划线分析, 将划线处的像素点换算成温度值进行对比分析, 分析结果如图8所示。 根据温度曲线的变化可以看出, 单一叶片的病斑区与健康区确实存在温度差异。 此外, 曲线的峰值区域集中在像素点为2535区域, 此处为恰好为叶片上病斑的位置。 比较三个曲线可以看出, 染病1天和染病3天时在像素点2535区域曲线的凸起较明显, 而在染病第5天, 曲线的走势区域平缓。 分析原因可知, 染病第5天时叶片的干枯面积逐渐变大, 温度差异降低, 故曲线的突起变得相对较平缓。

图8

Fig.8

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	图8 健康和染病区域的温度变化曲线Fig.8 The temperature curve of health and disease area

2.3.2 油菜菌核病侵染对油菜叶片温度的影响

基于叶片提取温度时避开了叶片上的经脉, 保证了叶片最大温度值与最小温度值的可靠性。 所以, 基于叶片尺度提取四项温度值(最大温度、 最小温度、 平均温度及最大温差)来分析菌核病对油菜温度的影响, 结果如图9所示。 结果表明, 病斑区域的四项温度值均高于健康区域。 其中, 最大温度值的三次对比结果表明, 病斑区域和健康区域温度差值分别为1.68, 0.47及1.0 ℃。 最小温度值的三次对比结果表明, 病斑区域和健康区域的温度差值分别为1.43, 0.715及0.93 ℃, 三次差值分别呈现递减的趋势。 从最大温差值的三次对比结果来看, 温度差值分别为0.27, 0.52及0.73 ℃, 且差值呈递增的趋势。 此外, 从平均温度的三次对比结果来看, 温度差异分别为1.79, 0.175及0.41 ℃, 且差值逐渐变小。 分析以上4个温度指数可知, 三次对比得到的差异指数均呈现递减的趋势, 分析原因可知随着病菌侵染天数的增加, 叶片的病斑面积逐渐变大, 导致整个叶片温度升高; 健康区域面积变小, 也意味着最小温度值所占的区域减小, 最终温度值逐渐趋于平稳。

图9

Fig.9

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	图9 染病后连续3 d油菜植株叶片的温度分析 (a): 最大温度值; (b): 最小温度; (c): 最大温差; (d): 平均温度Fig.9 Temperature analysis of rape leaf for 3 consecutive days after infection (a): Maximum temperature; (b): Minimum temperature; (c): Maximum temperature different; (d): Average temperature

同样对样本采用单因素方差分析, 结果如图9所示。 从分析结果可知, 最大温差值依然是显著性差异表现最明显的指数, 而最小温度值与染病天数不存在显著性差异。 平均温度和最大温度在第3天开始呈现显著性差异。 与基于冠层尺度的分析结果相似, 最大温差值可以对早期的病菌侵染进行识别。 此外, 可以将平均温度值、 最大温度值作为对油菜菌核病识别的辅助性指标。 但是最小温度值与染病天数不存在显著性差异, 无法作为单一指标对油菜菌核病的侵染进行分析。