高倍透射电子显微镜; UV-1601紫外可见分光光度计; Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪; F-98荧光分光光度计; 微波炉; 飞鸽TGL-15B离心机; Milli-Q型超纯水机。

聚乙二醇、 PBS缓冲液、 硫酸铜、 抗坏血酸、 蔗糖、 浓硫酸等均购自国药集团化学试剂有限公司; 所有试剂均为分析纯级, 且相关试剂溶液均使用超纯水(18.2 MΩ )进行配制。

CQDs通过微波介导法合成^[13], 具体方法如下:将6 mL聚乙二醇200 (PEG 200)和200 μ L浓H₂SO₄置于10 mL烧杯中, 搅拌混匀, 然后加入1 mL蔗糖水溶液(30%)混合搅拌10 min, 微波加热15 s。 在5 000 r· min^-1下离心15 min除去不溶物, 并用透析袋(MV 1000, 美国Thermo Fisher公司)在去离子水中透析24 h。 透析结束后, 用适量NaOH溶液调整碳量子点溶液pH值至7.0, 稀释至100 mL置于4 ℃下保存备用。

CuNCs的制备是在已有文献[14]的基础上改进合成的, 具体方法如下:取20 mL的CuSO₄水溶液(0.006 mol· L^-1), 然后加入2 mL的NaOH溶液(0.5 mol· L^-1), 在50 ℃水浴加热并剧烈搅拌2 min。 加入20 mL抗坏血酸水溶液(0.1 mol· L^-1)混合搅拌10 min。 用NaOH溶液将混合溶液的pH调节至8.0~9.0, 在50 ℃恒温条件下混合搅拌15 h, 得绿褐色的CuNCs溶液, 并用透析袋在去离子水中透析24 h, 将得到的透析液稀释至100 mL在4 ℃下储藏。

将制备的CuNCs与CQDs按比例混合, 磁力搅拌30 min形成CuNCs-CQDs复合溶液。 然后分别加入不同浓度的Hg²⁺标准溶液。 用1 mmol· L^-1的PBS缓冲液(pH 7.1)定容稀释至5 mL。 混合液在50 ℃恒温水浴条件下反应7 min。 在365 nm激发波下, 分别测量体系的荧光强度。 以体系中Hg²⁺的浓度为自变量, 荧光强度为因变量建立标准曲线。

选择性测试选择部分金属阳离子, 包括Ca²⁺, Mg²⁺, Al³⁺, Cd²⁺, Pb²⁺, Ni²⁺, Fe³⁺, Mn²⁺, K⁺, Na⁺, Zn²⁺, Cu²⁺(浓度为40 μ mol· L^-1), 分别测量其荧光发射光谱。 与空白样品和加入Hg²⁺(浓度为4 μ mol· L^-1)时比较CuNCs荧光猝灭率和CQDs-CuNCs双发射荧光峰比值。 稳定性测试分为两部分, 一是研究探针浓度漂移对实验结果造成的偏差, 通过控制CQDs-CuNCs复合物添加量(1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3 mL)来测定探针浓度漂移时的荧光光谱并进行比较; 二是研究不同温度对检测结果的影响, 分别将待测液温度控制在5, 10, 15, 20, 25和30 ℃时, 测量并记录不同温度下的荧光光谱。 以上检测结果偏移率均以公式:|c-c₀|/c₀× 100%:其中c为荧光法测得的Hg²⁺浓度, c₀为实际的Hg²⁺浓度。

采集中华绒鳌蟹样品, 洗去中华绒鳌蟹体表面污垢, 解剖, 取肝胰腺、 性腺和肌肉, 均充分研磨混匀, 于冰箱中冷冻保存。 取样品1.0 g, 放入聚四氟乙烯消解罐, 并加入4 mL硝酸, 然后加入2 mL过氧化氢, 静置过夜, 将消解罐置于微波消解仪中, 完成消解及赶酸程序, 得到螃蟹消化液备用。 为了验证CQDs-CuNCs复合体系用于检测螃蟹中Hg²⁺含量的可行性, 向消化液中加入不同浓度的Hg²⁺, 按照1.4节所述方法对螃蟹样品进行检测分析。

采用高倍透射电子显微镜(HRTEM)对所制备的CQDs, CuNCs和CQDs-CuNCs的形貌结构进行表征, 结果如图1所示。 CQDs对应的TEM图如图1(a)所示, 结果显示CQDs呈单分散球形, 粒径主要分布在1~5 nm, 插图所示的0.23 nm的晶格间距与石墨(100)的晶面相符^[15]; CuNCs对应的TEM图如图1(b)所示, 结果显示CuNCs具有较好的分散性, 呈球形, 粒径主要分布在4~8 nm, 插图所示的0.31 nm的晶格间距与对应的铜(102)晶面^[16]; CQDs-CuNCs复合体系对应的TEM图如图1(c)所示, 结果显示CQDs和CuNCs通过自组装发生部分结合, 主要是由于CQDs会通过分子间作用力与CuNCs进行结合^[11]。

图1

Fig.1

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	图1 制备的CQDs(a), CuNCs(b)和CQDs-CuNCs(c)复合体系的TEM图; CuNCs(1), CQDs(2), CQDs-CuNCs(3)的FTIR光谱图(d)Fig.1 TEM images of the as-prepared CQDs (a), CuNCs (b) and CQDs-CuNCs nanohybrids (c); (d) FTIR image of CuNCs (1), CQDs (2) and CQDs-CuNCs (3)

同时, 本研究利用傅里叶变换红外光谱技术(FTIR)对CQDs, CuNCs和CQDs-CuNCs的表面基团进行表征, 结果如图1(d)所示。 CuNCs对应的FTIR光谱[图1(d)中曲线1]1 080, 1 382, 1 612和3 350 cm^-1处有明显的特征吸收峰, 分别对应着— C— O— C— , — C=O— , — C=C— , — OH的伸缩振动^[13], 表明CuNCs的表面修饰有抗坏血酸稳定剂^[14]。 CQDs对应的FTIR光谱[图1(d)中曲线2]在1 080, 2 890和3 350 cm^-1处有明显的特征吸收峰, 分别对应着— C— O— C— , — CH₂— 和— OH的伸缩振动。 CQDs-CuNCs对应的FTIR光谱[图1(d)中曲线3]同时存在CQDs和CuNCs的吸收峰, 但吸收峰强度相比两者有所增加, 且3 350 cm^-1处特征峰出现左移, 表明CQD-CuNCs复合体系已成功制备。

CQDs, CuNCs和CQDs-CuNCs对应的紫外吸收和荧光发射光谱如图2所示。 CQDs[图2 (a)]在365 nm的激发波下, 在545 nm处存在明显的荧光发射峰; 同时, 在对应的紫外灯照射下, CQDs溶液呈现出明亮的橙黄色荧光[图2 (a)插图所示]。 CuNCs[图2 (b)]在443 nm处具有很强的荧光发射性能, 并呈现明亮蓝色荧光。 CQDs-CuNCs复合体系[图2 (c)]在443和545 nm处存在明显的特征荧光发射峰, 分别对应CuNCs和CQDs特征发射, 说明该复合体系具有双发射荧光特性, CQDs-CuNCs在紫外灯下呈现明亮的蓝色荧光, 这可能是因为在复合体系中CuNCs的荧光发射强度高于CQDs的荧光发射强度^[13]。

图2

Fig.2

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	图2 CQDs(a), CuNCs(b), CQDs-CuNCs复合体系(c)的 紫外吸收光谱(红色虚线)和荧光发射光谱(蓝色实线)Fig.2 UV-Vis absorption spectra (red dash curves) and FL emission spectra (blue solid curves) of CQDs (a), CuNCs (b) and dual-emitting CQDs-CuNCs nanohybrids (c)

为了提高Hg²⁺检测的灵敏性, 对检测参数CuNCs/CQDs比例、 体系pH和反应时间分别进行了优化^{[13, 17]}。 CuNCs/CQDs比例对荧光强度的影响如图3(a)所示, 当CuNCs/CQDs添加比率为1:2时得到双发射峰的最佳I_{443 nm}/I_{545 nm}比值, 故选取CuNCs:CQDs=1:2为最适比例。 反应体系pH值对Hg²⁺检测信号的影响如图3(b)所示, 当pH为7.5时, |F₁-F₂|达到最大(F₁和F₂分别表示Hg²⁺浓度为4 μ mol· L^-1时和不含Hg²⁺时I_{443 nm}/I_{545 nm}的值), 原因可能是酸性或碱性条件会改变体系电性, 致使Hg²⁺与复合体系不易发生相互作用^[6]。 故选择体系pH为7.5。 反应时间对Hg²⁺检测信号的影响如图3(c)所示, 测量加入Hg²⁺后不同反应时间(1, 3, 5, 7, 9和11 min)时的荧光强度, 7 min时荧光强度达到稳定, 之后荧光强度基本不变, 故选取7min作为最优反应时间。

图3

Fig.3

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	图3 CuNCs/CQDs比例(a)、 pH(b)和反应时间(c)对荧光体系的影响Fig.3 Effect of CuNCs/CQDs ratio (a), pH (b) and incubation time (c) on the fluorescence system

在优化条件下, CuNCs单发射荧光强度和CQDs-CuNCs双发射荧光强度比值与Hg²⁺浓度之间的关系如图4所示。 CuNCs对Hg²⁺的荧光响应特征如图4(a)所示, 随着Hg²⁺浓度增加, CuNCs荧光强度逐渐被猝灭。 CuNCs荧光信号(I_{443 nm})与Hg²⁺浓度的相关关系如图4(b)所示, 以CuNCs荧光猝灭率(F₀-F)/F₀(其中F₀和F分别为Hg²⁺不存在和存在时的荧光强度)为纵坐标, Hg²⁺浓度为横坐标, 在0.1~12 μ mol· L^-1浓度范围内具有良好的线性关系(R²=0.991 6), 线性回归方程为y=0.021 8+0.077x。 根据检测限公式3σ /S(σ 是十一次空白测定的标准偏差, S是拟合直线的斜率), 得最低检测限为3.62 nmol· L^-1。 CQDs-CuNCs对汞离子的荧光响应特征如图4(c)所示, 随着Hg²⁺浓度增加, CuNCs荧光强度逐渐被猝灭, CQDs的荧光强度几乎不变。 CQDs-CuNCs荧光信号(I_{443 nm}/I_{545 nm})与Hg²⁺浓度的相关关系如图4(d)所示, 以I_{443 nm}/I_{545 nm}为纵坐标, Hg²⁺浓度为横坐标, 可知线性回归方程为y=2.304-0.14x (R²=0.994 7), 检测限为2.83 nmol· L^-1。 以上结果表明, CQDs-CuNCs复合体系用于检测Hg²⁺时比单发射CuNCs具有更高的灵敏度和稳定性。

图4

Fig.4

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图4 Hg2+与CuNCs(a), CQDs-CuNCs(c)荧光发射光谱关系, 插图为365 nm下荧光状态, (b)Hg2+与CuNCs I443相关性曲线, (d)Hg2+与CQDs-CuNCs I443/I545相关性曲线, (e)加入Hg2+后CQDs-CuNCs TEM图Fig.4 FL emission spectra of CuNCs (a), CQDs-CuNCs (c) after the addition of Hg2+ with a concentration varying from 012 μ mol· L-1. Inserted photographs were obtained upon excitation with a UV lamp at 365 nm; (b) Linear plotting relationship between I443nm and CHg2+; (d) Linear plotting relationship between I443nm/I545nm and CHg2+; (e)TEM images of the CQDs-CuNCs nanohybrids with Hg2+

CQDs-CuNCs比率型荧光探针的构建以及Hg²⁺的检测原理如图5所示, CQDs和CuNCs分别在545和443 nm处具有良好的荧光发射性能, CQDs与CuNCs通过分子间作用力与进行结合, 从而形成CQDs-CuNCs复合体系[图1(c)]。 CuNCs和Hg²⁺之间存在“ 配体金属电荷转移” , 电荷转移导致CuNCs团聚, 在驰豫过程中CuNCs荧光猝灭^[1]。 因此, 当Hg²⁺加入后, 复合体系中CuNCs表面配体的负电荷与带有正电荷的Hg²⁺发生转移, 引起CuNCs表面电位不稳定而发生团聚[如图4(e)所示], 并诱导其在443 nm处的荧光猝灭^{[1, 14]}, CQDs作为内部校正信号, 荧光强度保持不变。 依据两者荧光强度的比值(I_{443 nm}/I_{545 nm})随Hg²⁺浓度的变化关系实现Hg²⁺的定量检测。 通过与已有文献对比^{[1, 3, 5, 6, 8, 18]}, 本研究所构建的CQDs-CuNCs比率型探针对Hg²⁺的检测在检测限、 灵敏度以及制造成本等方面具有优势。

图5

Fig.5

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	图5 Hg2+检测原理图Fig.5 The principle diagram for detection of Hg2+ by the system

纳米荧光探针的检测稳定性也是衡量其自身性能的重要指标。 荧光物质的荧光性能不仅受自身分子结构的影响, 还与自身浓度和环境因素有关。 本文探究了CQDs-CuNCs比率型探针和单发射CuNCs探针在自身浓度偏移时和不同测量温度下的检测稳定性。

探针浓度变化对检测体系稳定性的影响如图6(a)所示。 荧光探针添加量分别为1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2和2.3 mL, CQDs-CuNCs复合体系和CuNCs检测结果的偏移率分别为0.5%1%和2%6%。 这可能是因为单发射的CuNCs在探针浓度发生偏移时其荧光强度的改变造成检测结果偏差较大^[8], 而CQDs-CuNCs复合体系在探针浓度发生偏移时双发射荧光强度同时发生改变, 其中内置校正信号可以通过自身调节和校准以减少探针浓度产生的检测误差^[8]。 因此, CQDs-CuNCs比率型探针在探针浓度漂移时的检测稳定性更高。

图6

Fig.6

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	图6 CQDs-CuNCs复合体系和CuNCs的检测稳定性Fig.6 Stability of the CQDs-CuNCs and CuNCs fluorescence system

温度变化对检测体系稳定性的影响如图6(b)所示。 在不同温度条件下(5, 10, 15, 20, 25和30 ℃), CQDs-CuNCs复合体系和CuNCs检测结果的偏移率分别为01%和0.5%6%。 与CuNCs相比, CQDs-CuNCs复合体系对环境温度的敏感性更低。 以上结果表明, 本文研究的CQDs-CuNCs比率型探针相比单通道CuNCs由于内置荧光信号的自校准功能而具有更高的检测稳定性。

选择性高低是荧光传感器的另一个关键性的评价指标。 本研究选取了部分金属阳离子(包括Ca²⁺, Mg²⁺, Al³⁺, Cd²⁺, Pb²⁺, Ni²⁺, Fe³⁺, Mn²⁺, K⁺, Na⁺, Zn²⁺, Cu²⁺), 作为干扰离子验证CQDs-CuNCs复合体系和CuNCs的选择性。 当Hg²⁺的浓度为4 μ mol· L^-1, 其他干扰离子的浓度为40 μ mol· L^-1时, CuNCs和CQDs-CuNCs复合体系对Hg²⁺的选择性检测结果如图7(a)和(b)所示, 结果表明其余阳离子对体系的影响较小, 仅存在轻微变化, 而对Hg²⁺作用较为明显, 这说明CQDs-CuNCs复合体系和CuNCs均对Hg²⁺有较好的选择性。

图7

Fig.7

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	图7 CuNCs(a)和CQDs-CuNCs(b)荧光体系对Hg2+的选择性Fig.7 Selectivity of the CuNCs (a) and CQDs-CuNCs (b) fluorescence system towards Hg2+

为了评估CuNCs和CQDs-CuNCs复合体系在实际样本中的检测效果, 本研究在螃蟹样品中采用加标回收的方法对Hg²⁺进行检测研究, 将不同浓度的Hg²⁺(分别为2, 5和10 μ mol· L^-1)标准溶液, 分别加入到预处理后的螃蟹消化液中, 在优化的条件下对加标样品进行荧光分析, 每组实验结果取三次平行实验的平均值, 结果如表1所示。 由表1可知, CQDs-CuNCs复合体系得到回收率为102.5%105.4%, CuNCs体系得到回收率为104.2%112.5%, 表明本研究建立的CQDs-CuNCs复合体系可以用于螃蟹样品中Hg²⁺的检测, 且该比率型复合体系相比于单发射荧光检测具有更高准确性和稳定性。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 螃蟹中Hg2+的测定及回收率实验结果 Table 1 Detection results and recoveries of Hg2+ in mitten crab 样品 编号 加标量/ (μ mol· L-1) 荧光法/(μ mol· L-1)(%) CuNCs 回收率 CQDs-CuNCs 回收率 1 2.00 2.25 112.5 2.05 102.5 2 5.00 5.52 110.4 5.27 105.4 3 10.00 10.42 104.2 10.32 103.2

表1 螃蟹中Hg2+的测定及回收率实验结果 Table 1 Detection results and recoveries of Hg2+ in mitten crab