引用本文
耿淑琴, 樊肇胜, 刘豪, 曾胜, 张艳玲, 董阿力德尔图, 周群, 孙素琴. 短瓣金莲花指标成分的红外光谱快速分析[J]. 光谱学与光谱分析, 2019,39(11): 3624-3628.
GENG Shu-qin, FAN Zhao-sheng, LIU Hao, ZENG Sheng, ZHANG Yan-ling, DONG Alideertu, ZHOU Qun, SUN Su-qin. Rapid Analysis of the Quality Control Components of Trollius ledebouri by Infrared Spectroscopy [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2019,39(11): 3624-3628.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2019)11-3624-05  
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短瓣金莲花指标成分的红外光谱快速分析
耿淑琴1, 樊肇胜2, 刘豪1, 曾胜1, 张艳玲1,*, 董阿力德尔图1, 周群2, 孙素琴2
1. 内蒙古大学化学化工学院, 内蒙古 呼和浩特 010021
2. 清华大学化学系, 北京 100084
*通讯联系人 e-mail: zhylthu@126.com

作者简介: 耿淑琴, 1993年生, 内蒙古大学化学化工学院硕士研究生 e-mail: gshq010@163.com

收稿日期: 2018-09-28
基金: 国家自然科学基金项目(81760710), 内蒙古自然科学基金项目(2016MS08121), 内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目(NJZZ13015)和内蒙古大学高层次人才引进科研启动项目(Z20100108)资助
摘要

将现代红外光谱分析技术与化学计量学方法相结合, 建立利用红外光谱对短瓣金莲花药材的指标成分进行快速定量分析的方法。 以高效液相色谱法获得短瓣金莲花指标成分(荭草苷、 牡荆苷)的含量作为参考数据, 以傅里叶变换红外光谱技术获取其红外光谱图, 在此基础上利用化学计量学方法将指标成分与红外光谱图数据关联, 构建指标成分的快速预测模型。 以不同比例甲醇-水作为溶剂, 采用室温浸提、 加热回流、 超声辅助工艺提取获得36个短瓣金莲花药材提取物。 利用高效液相色谱法测试短瓣金莲花提取物的荭草苷和牡荆苷含量, 并以傅里叶变换红外光谱仪辅以水平衰减全反射附件测试各样品的红外光谱图。 分别选取29个提取物样品作为检验集, 其余为校正集, 采用TQ Analyst EZ Edition软件进行建模。 以交叉验证相关系数( R2)和交叉验证误差均方根(RMSEC)为指标选择光谱预处理方法、 定量分析方法和建模波段, 用预测误差均方根(RMSEP)考核模型的预测效果。 通过筛选得到优化的光谱预处理方法为标准正态分布校正(SNV)和二阶导数(13点平滑), 定量分析方法为偏最小二乘(PLS)方法, 荭草苷和牡荆苷的最佳波段分别为2 050~650和1 900~650 cm-1。 以PLS法构建的荭草苷和牡荆苷模型的相关系数分别为0.919 8和0.970 8, 模型预测结果的相对偏差分别在-2.0%~3.2%和-3.4%~4.7%之间。 鉴于红外光谱技术所具有的测试迅速、 微观宏观指纹特性、 定性定量皆可分析、 对环境无污染等特点, 利用红外光谱法可对中药提取物的指标成分进行快速、 准确、 环保、 高效的分析, 为中药的质量控制提供了新的思路和解决方案。

关键词: 红外光谱; 快速分析; 短瓣金莲花; 荭草苷; 牡荆苷
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Rapid Analysis of the Quality Control Components of Trollius ledebouri by Infrared Spectroscopy
GENG Shu-qin1, FAN Zhao-sheng2, LIU Hao1, ZENG Sheng1, ZHANG Yan-ling1,*, DONG Alideertu1, ZHOU Qun2, SUN Su-qin2
1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China
2. Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China
*Corresponding author
Abstract

Combined with chemometrics methods, rapid quantitative analysis of the quality control components of Trollius ledebouri was developed by modern infrared spectroscopy. The reference data of the representative components, orientin and vitexin, were obtained by HPLC method, and the infrared spectra were obtained by Fourier transform infrared spectroscopy. On this basis, the index components were correlated with the infrared spectra data by chemometrics methods, and the fast prediction models of the index components were established. Thirty-six extracts of Trollius ledebouri were obtained by room temperature extraction, heating reflux and ultrasound-assisted extraction with different ratios of methanol-water as solvent. The contents of orientin and vitexin in the extracts of Trollius ledebouri were determined by HPLC method, and the infrared spectra of the samples were measured by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) aided by horizontal attenuated total reflectance (HATR) accessory. TQ Analyst EZ Edition software was used to establish the models, in which 29 extract samples were as test set and the rest as calibration set. Cross validation correlation coefficient ( R2) and cross validation error mean square root (RMSEC) were used as indexes to select spectral pretreatment method, quantitative analysis method and modeling wave range, and root mean square error of prediction (RMSEP) was used to evaluate the prediction effect of the model. The optimized spectral pretreatment methods were standard normal distribution verification (SNV) correction and second derivative (13-point smoothing) of standard normal distribution. The quantitative analysis method was PLS. And the optimal wave range of orientin and vitexin were 2 050~650 and 1 900~650 cm-1, respectively. The correlation coefficients of orientin and vitexin models constructed by PLS method were 0.919 8 and 0.970 8, respectively. The relative deviations of the predicted results were -2.0%~3.2% and -3.4%~4.7%, respectively. Since the possessing has unique advantages, such as rapid measurement, fingerprint characteristics, qualitative and quantitative analysis, being environment friendly, the infrared spectroscopy can be used to indicate the representative ingredients of Chinese herbal extracts quickly, accurately, environment friendly and efficiently, thus providing a new idea and a feasible solution for the quality control of traditional Chinese herbal medicines.

Keyword: Infrared spectroscopy; Fast analysis; Trollius ledebouri Reichb; Orientin; Vitexin
引 言

短瓣金莲花(Trollius ledebouri Reichb)系毛茛科金莲花属植物, 主要分布于我国黑龙江及内蒙古东北部地区, 以花入药, 具有清热解毒、 消肿、 明目的功效, 主要用于治疗急慢性扁桃体炎、 急性中耳炎、 急性淋巴管炎等症[1, 2]。 现代药理研究表明, 短瓣金莲花具有抗菌、 抗炎镇痛、 抗氧化等活性[3, 4]。 文献报道短瓣金莲花含有黄酮(苷)类、 酚酸类、 香豆素类、 苯乙素类、 挥发油等多种化学成分[5, 6, 7, 8]。 目前对该药材质量标准的研究多是以高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定其指标成分, 如荭草苷、 牡荆苷等[9]。 高效液相色谱法是目前广泛使用的高效分离分析技术, 然而该法费用较高, 分离方法的建立及测试往往费时繁琐, 所需大量流动相(甲醇、 乙腈等)具有毒性, 而且利用该法定性分析时通常需要借助于标准物质才能完成。 因此, 需要一种快速、 有效、 可行的方法对中药提取物进行整体系统的分析及逐一鉴别。

红外光谱可在其波长范围内提供不同分子特征的光谱信息, 经典的红外光谱多是对单一成分或简单组分进行定性和定量分析[10]。 而要利用红外光谱对食品、 药品等复杂体系进行定性和定量分析, 必须与化学计量学的方法结合。 化学计量学是一门新兴学科, 它可以应用数学、 统计学与信息理论、 计算机科学的方法和手段, 最有效地获取体系有用的特征数据, 并通过解析测量数据最大限度地从中提取有关物质的定性、 定量、 形态、 结构等信息[11]。 此外, 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)技术具有指纹特性强、 取样量小、 操作简便、 测试迅速、 对环境无污染等特点。 因此, 现代红外光谱分析技术结合化学计量学方法, 能够为中药、 食品等复杂体系的化学成分研究提供直接、 快速、 有效的手段。 目前该技术在中药材、 中药饮片、 中药制剂以及食品等复杂体系的研究中已有了大量的应用[12, 13, 14, 15]。

以水平衰减全反射(horizontal attenuated total reflection, HATR)附件测试短瓣金莲花不同提取物样品的红外光谱图, 借助高效液相色谱法测试各样品的荭草苷和牡荆苷含量, 并结合化学计量学方法构建短瓣金莲花的荭草苷和牡荆苷模型, 以建立利用红外光谱法对该药材的指标成分进行直接、 快速分析的方法。

1 实验部分
1.1 试剂与仪器

短瓣金莲花(Trollius ledebouri Reichb)药材购于亳州市京皖中药饮片厂(产地: 东北)。 石油醚(bp. 30~60 ℃)、 无水乙醇、 95%乙醇、 甲醇、 磷酸, 购自天津市北联精细化学品开发有限公司, 均为分析纯; 色谱甲醇, 天津市风船化学试剂科技有限公司。 纯水由Milli-Q Direct 8超纯水系统产生。 荭草苷(以97.9%计)、 牡荆苷(以94.9%计)标准品, 中国食品药品检定研究院。

Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher); U-3000高效液相色谱仪(美国戴安); RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣); SHB-Ⅲ 循环水式真空泵(巩义予华); DZF-6090真空干燥箱(上海一恒); Milli-Q Direct 8超纯水器(美国Millipore); PTHW型调温电热套(巩义予华); VFD-1000冷冻干燥机(北京博医康); SK6210LHC双频加热型超声波清洗器(上海科导)。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

将短瓣金莲花干燥、 粉碎, 分别称取适量, 采用室温浸提、 加热回流和超声辅助3种提取工艺, 石油醚(b.p. 30~60 ℃)脱脂后, 依次分别用100%, 95%, 90%, …, 20%, 10%甲醇-水和去离子水提取, 各3次, 提取液过滤、 减压浓缩并冷冻干燥, 得到36个提取物。

1.2.2 HPLC测定荭草苷和牡荆苷含量

色谱柱: Agilent Technologies ZORBAX SB-C18 4.6× 250 mm, 5 μ m; 流动相: 甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱, 0 min时甲醇-0.1%磷酸溶液10:90, 17 min时甲醇-0.1%磷酸溶液35:65, 40min时甲醇-0.1%磷酸80:20; 流速1.0 mL· min-1; 检测波长340 nm; 柱温为35℃; 进样量10 μ L。

用60%甲醇配制一系列浓度的混标溶液, 荭草苷标准品溶液的浓度分别为150.0, 75.0, 37.5, 18.8和9.4 μ g· mL-1, 牡荆苷标准品溶液的浓度分别为170.0, 85.0, 42.5, 21.2和10.6 μ g· mL-1; 用60%甲醇配制短瓣金莲花各提取物的溶液(0.1 mg· mL-1)。 以上样品均用0.45 μ m有机系滤膜过滤后待用。

1.2.3 红外光谱采集

Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪辅以水平衰减全反射(horizontal attenuated total reflectance, HATR)附件, 光谱范围4 000~650 cm-1; DTGS检测器, 分辨率4 cm-1, 扫描次数64次, OPD速度为0.2 cm-1· s-1, 扫描时实时扣除水和CO2的干扰。

1.2.4 红外光谱方法学考察

1.2.4.1 精密度试验

取同一样品溶液, 用HATR附件连续测定5次。 采用OMNIC 8.2.388软件中谱图质量检测功能比较5张红外光谱图, 谱图间相关系数分别为0.995 6, 0.998 2, 0.998 6, 0.998 1, 1.000 0, RSD=0.16%。

1.2.4.2 重复性试验

同一份样品, 分别取样5次, 用HATR附件测定。 采用OMNIC 8.2.388软件中谱图质量检测功能比较5张红外光谱图, 谱图间关系数分别为1.000 0, 0.996 0, 0.997 0, 0.998 4, 0.998 4, RSD=0.15%。

1.2.5 建模方法

采用仪器自带TQ Analyst EZ Edition软件进行建模。 根据HPLC定量分析荭草苷和牡荆苷的结果, 分别选取7个提取物样品作为检验集, 其余为校正集。 以交叉验证相关系数(R2)和交叉验证误差均方根(root mean square error of cross-validation, RMSEC)为指标比较不同光谱预处理方法和不同波段对模型效果的影响, 对未知样本的预测效果用预测误差均方根(root mean square error of prediction, RMSEP)考核。

2 结果与讨论
2.1 短瓣金莲花不同提取物的荭草苷和牡荆苷含量

将荭草苷和牡荆苷标准品溶液使用高效液相色谱仪分析3次, 使用该仪器自带软件计算色谱峰积分面积取平均值。 以峰面积为横坐标, 浓度为纵坐标绘制标准曲线方程分别为, 牡荆苷: y=0.100 7x+0.009 6, R2=0.999 4; 荭草苷: y=0.200 1x-0.32, R2=0.999 7。

将短瓣金莲花各提取物采用相同色谱条件进行测试分析, 得到各个荭草苷和牡荆苷含量, 见表1。

表1 短瓣金莲花各提取物的荭草苷和牡荆苷含量 Table 1 Contents of orientin and vitexin in the different extracts of Trollius ledebouri
2.2 定量分析方法和预处理方法的选择

首先选择不同的定量分析方法: 朗伯比尔定律(simple Beer’ s law)、 偏最小二乘法(partial least squares, PLS)和主成分回归法(principal component regression, PCR); 然后选择不同的光谱预处理方法: 导数处理(derivative)、 多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)和标准正态变量校正(standard normal distribution verification, SNV)。 通过筛选不同的定量分析方法和光谱预处理方法, 最终得到了优化的荭草苷和牡荆苷定量分析校正模型, 采用PLS方法建立模型, 标准正态分布SNV校正和二阶导数(13点平滑)预处理。

2.3 波段的选择

PLS方法可以选择全波段范围作为定量分析区间, 亦可以选择部分波段作为定量分析区间。 二者各有利弊: 全波段范围可以包含全部的样品信息, 但是所含背景信息也较多, 会影响样品光谱; 选取部分波段虽不能包含全部的样品信息, 但是样品的吸收受其他因素的干扰较小。 所以, 在建立定量模型时要反复实验以确定最佳的波段范围。 表2和表3分别为荭草苷和牡荆苷二阶导数和SNV预处理的方法选取不同波段时的建模效果。 可见, 荭草苷二阶导数和SNV预处理方法的最佳波段为2 050~650 cm-1; 牡荆苷二阶导数+SNV预处理方法的最佳波段为1 900~650 cm-1。

表2 不同波段范围对荭草苷建模结果的影响 Table 2 Influence of IR spectra wavelength ranges on the model of orientin
表3 不同波段范围牡荆苷建模结果的影响 Table 3 Influence of IR spectra wavelength ranges on the model of vitexin
2.4 校正模型的建立

根据前述优化方案, 以PLS方法建立了模型。 荭草苷校正模型的R2为0.919 8, RMSEC为3.75, 预测误差均方根RMSEP为1.65; 牡荆苷校正模型的R2为0.970 8, RMSEC为1.18, 预测误差均方郭RMSEP为0.704。

利用建立的荭草苷和牡荆苷模型对检验集进行预测, 结果如表4和表5所示。 荭草苷模型预测结果的相对偏差在-2.0%~3.2%之间, 牡荆苷模型预测结果的相对偏差在-3.4%~4.7%之间。

表4 荭草苷模型的预测结果 Table 4 Prediction results for the model of orientin
表5 牡荆苷模型的预测结果 Table 5 Prediction results for the model of vitexin
3 结 论

建立了一种利用红外光谱技术预测中药材指标成分的方法, 从得到的模型可以看出短瓣金莲花药材提取物的红外光谱与指标成分之间存在很好的相关性, R2> 0.91; 且模型预测结果的相对偏差在± 5%之内。 红外光谱技术具有指纹特性强、 取样量小、 操作简便、 测试迅速、 对环境无污染、 定量准确等特点。 本文只对短瓣金莲花药材中的两种指标成分进行了预测。 在获取大量相关数据的基础上, 该方法可对某种药材的多个成分及整体特征甚至药效、 药理等进行预测评价, 不失为一种很好的中药材质量控制的手段。 能够为中药、 食品等复杂体系的化学成分研究提供直接、 快速、 有效的研究手段, 可以缩短研究周期, 提高研究效率。

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