叶黄素和β -胡萝卜素的标准物购自Sigma化学试剂有限公司, 正己烷(w%≥ 97%)、 异丙醇(w%≥ 99.5%)均为分析纯, 购自上海凌峰化学试剂有限公司。 所有化学试剂在使用过程中均未进行再提纯。 配制样品溶液的实验用水均为超纯水(18.2 MΩ · cm, Sartorius arium 611DI, 德国)。

使用DXR2xi共聚焦显微拉曼光谱仪(Thermofisher, 美国), 配备EMCCD检测器和455 nm的DPSS激光器, 激光最大输出功率6 mW。 采用BX51显微镜的10倍物镜将激光聚焦在待测样品上。 光谱分辨率为5 cm^-1。 在使用拉曼光谱法测定烟草萃取液之前, 用聚苯乙烯对拉曼光谱仪进行了校正。 此后, 除特殊说明外, 实验数据均在相同条件下获得。 紫外-可见光谱仪(Lambda 950, PerkinElmer)。

称量(1.000 0± 0.003 0)g烟末, 放入玻璃瓶, 用定量加液器加入95%的正己烷10 mL。 然后超声振荡30 min, 静置30 min, 取出澄清液过0.22 μ m膜, 最后取2 mL到玻璃色谱瓶, 待测。

将装有烟草样本提取液2 mL的色谱瓶密封后置于光学检测平台上进行拉曼光谱采集, 扫描次数1 000次, 扫描波段为50~3 500 cm^-1。 每个样本选取3个不同的位置各采集一条光谱, 最后选用平均光谱进行分析。 特别选择1个样品, 在全部样品共计5 d的检测过程中进行连续的监测, 平行测定3次, 其平均光谱用于全部样品光谱的归一化处理, 以校正因每次检测环境改变而产生的光谱改变, 详见2.2部分。

本文探索了归一化、 求导和波段选择等光谱预处理方法对建模效果的影响。 其中, 归一化是计算光谱与溶剂峰(2 877 cm^-1)的比值; 求导采用Savitzky-Golay方法, 窗口大小选为9, 拟合阶数为3。

为了建立及评价多元校正模型, 所有141个烟草样本被分为校正集和独立预测集。 对浓度值进行排序后, 每三个连续样本中的第二个被选出来作为预测样本, 剩下的作为校正样本。 因此, 校正集和预测集的样本数分别为94和47。

利用Monte-Carlo交互检验方法选取PLS模型中的隐变量数。 通过计算Root Mean Square Error of Prediction(RMSEP)和Root Mean Square Error of Calibration(RMSEC)来对模型进行评价, 计算公式如下

均方根误差(RMSE)=∑i=1n(y˙i-yi)2n

式中, n为样本数, y_i和 y˙i分别是第i个样本的参考浓度和预测浓度, 在本文中, 光谱数据X和浓度y均做过中心化处理。

2.1.1 激发光波长的选择

在激发光波长的选取中考虑了455, 514和785 nm这3种激发光波长。 从图1展示的叶黄素和β -胡萝卜素的紫外-可见吸收光谱来看, 与455 nm的激发光波长相比, 514和785 nm的激发光波长看起来更适合类胡萝卜素, 因为荧光背景较弱。 但是根据散射定律, 入射光的波长和拉曼强度的四次方成反比^[15], 因此在455 nm的激发光波长能产生更强的拉曼信号。 早在1979年, Forrest^[16]就建议选取488.0和514.5 nm的激发光波长来对烟草中的叶黄素与β -胡萝卜素进行测定。 综合考虑拉曼强度与荧光背景, 最终选择采用455 nm作为激发光波长。

图1

Fig.1

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	图1 β -胡萝卜素(a)和叶黄素(b)的紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis spectra of β -carotene (a) and lutein (b)

2.1.2 萃取溶剂的选择

在拉曼光谱的测量过程中, 萃取溶剂对其有很大影响^[17]。 如图2所示, 图2a和b分别为正己烷和异丙醇标准溶液的拉曼光谱图, 结合他们分别作为萃取溶剂的烟草样本提取液(图2c和d)的拉曼光谱可以看出, 选取1 159和1 529 cm^-1处的谱峰可以作为叶黄素和β -胡萝卜素的特征峰。 因为采用异丙醇(图2d)作为萃取剂得到的拉曼光谱的信号强度比正己烷(图2c)作为萃取剂得到的拉曼光谱的信号强度低。 而且从图2d光谱上的齿轮形状来看, 以异丙醇作为萃取剂所产生的荧光背景更强, 尽管仪器软件已经进行过背景扣除。 类胡萝卜素是一种C— C键和C=C键相互交替的直线型分子结构, 当分子的有序性良好时(即分子链又长又直时), π 电子离域产生大的扩展, 使其具有较好的光学性质、 宽的电子吸收带和较大的拉曼活性。 非极性溶质在非极性溶剂中, 不存在诱导力、 取向力、 与电偶矩相关的各种静电作用。 考虑到类胡萝卜素分子的有序性, 在极性较小的溶剂正己烷中, 有效共轭长度增大, 拉曼散射截面大^[18]。 因此, 选择正己烷作为萃取溶剂。

图2

Fig.2

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	图2 正己烷a和异丙醇b的标准溶液的拉曼光谱; 正己烷和异丙醇分别作为萃取溶剂的烟草样本提取液c和d的拉曼光谱 2.1.3 光学平台到焦平面间距离的选择Fig.2 Raman spectra of hexane a, isopropanol b, tobacco sample extracted by hexane c and tobacco sample extracted by isopropanol d

为了避免样品测量时溶剂挥发, 同时方便测量, 样品的萃取液被装入玻璃瓶密封后进行拉曼光谱测量。 因此本工作考察了光学平台到焦平面的距离。 如图3(a)所示, 玻璃瓶被置于光学平台上, 当不断调节光学平台与焦平面间距离的时候, 拉曼强度也在不断变化。 如图3(a)中红、 蓝、 绿三条线所示, 它们分别代表三种典型情况的焦平面。 在图3(b)中的上面一条拉曼光谱对应的是图3(a)中蓝线所代表的焦平面, 明显看出, 由于玻璃瓶的影响, 拉曼效应并不完美。 当焦平面运动到图3(a)中的红线的位置时, 所得到的拉曼信号较好, 说明拉曼效应较完美。 而当焦平面运动到图3(a)中绿线的位置时, 拉曼强度有所下降, 表明随着焦平面离检测器位置的不断变远, 所接收到的拉曼信号逐渐降低。 因此本工作系统地考察焦平面到光学平台间的距离, 如图3(c)所示, 将距离调整在600~800 μ m之间能产生较好的拉曼信号。

图3

Fig.3

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	图3 置于玻璃瓶中的烟草萃取液(a), 典型焦平面的拉曼光谱图(b)和系统地考察焦平面与光学平台间不同距离所对应的特征峰的拉曼强度(c)Fig.3 Extracted solution of tobacco sample in the glass bottle (a), Raman spectra of its typical focal plane (b) and Raman intensity with the distance between the focal plane and the optical platform was investigated systematically (c)

建立多元校正定量模型的目的是为了今后的应用, 不同时间测定的光谱有可能因为各种物理因素(如仪器操作条件等)的不同而发生变化。 图4显示的是连续5 d所监测的特定样品的拉曼特征峰强度的变化情况, 主要考察叶黄素和β -胡萝卜素在1 159和1 529 cm^-1这两个特征峰处的拉曼强度的变化情况, 通过计算5 d内1 159和1 529 cm^-1的相对标准偏差分别为6.30%和7.83%, 均大于5%, 因此可认为由激光强度和仪器采集效率变化造成的信号强度偏差在5 d内不可忽略。 因此, 为了消除系统误差, 归一化方法显得尤为重要。

图4

Fig.4

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	图4 特定样品重复5 d在1 159和1 529 cm-1处的拉曼强度归一化前(a)和归一化后(b)的变化图Fig.4 Raman intensity variation of a specific sample at 1 159 and 1 529 cm-1 repeated for 5 days before (a) and after (b) normalization

本文选取正己烷在2 877 cm^-1处的特征峰作为内标峰, 样品所有的拉曼信号强度都除以内标峰来做归一处理。 从图4(a)和(b)归一化前后强度变化情况来看, 可以看出能够显著减小变化, 并且RSD得到了减少, RSD分别降低为1.6%和2.4%。 表1结果显示, 在光谱归一化后, PLS模型的性能显著提升。 所以, 在后续的计算中拉曼光谱均做了归一化处理。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 归一化对叶黄素和β -胡萝卜素的PLS模型性能的影响 Table 1 The effects of normalization on the performance of the PLS models built on lutein and β -carotene Normalization LVs RMSEC/(μ g· g-1) RMSEP/(μ g· g-1) Rcali Rtest Lutein No 2 7.92 8.02 0.933 7 0.934 2 Yes 4 6.56 7.08 0.955 0 0.948 4 β -carotene No 8 1.91 3.30 0.970 9 0.924 6 Yes 9 1.45 2.84 0.983 3 0.944 6 Note: LVs is the number of latent variables 注: LVs是指隐变量数

表1 归一化对叶黄素和β -胡萝卜素的PLS模型性能的影响 Table 1 The effects of normalization on the performance of the PLS models built on lutein and β -carotene

图5绘出了141个烟草样本归一化处理后的全波段的拉曼光谱图以及叶黄素、 β -胡萝卜素和正己烷的标准拉曼光谱图。 1 529 cm^-1处的拉曼峰对应的是C=C键的伸缩振动^[19], 这是多烯链最重要的特征峰之一。 另一个强特征峰1 159 cm^-1对应的是C— C^[20]键的伸缩振动。 1 006 cm^-1处的特征峰是由于甲基和碳链之间的摇摆振动而产生的。 根据图5的叶黄素和β -胡萝卜素的标准拉曼光谱可以观察到, 在1 529, 1 159和1 006 cm^-1处有严重的峰重叠, 由于叶黄素和β -胡萝卜素的分子结构相似, 所以传统的单变量校正曲线很难进行定量分析。 因此本文采用PLS的多元校正方法, 因为PLS可以利用多个变量来处理光谱重叠问题, 从而建立校正模型。

图5

Fig.5

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	图5 烟草样本的拉曼光谱图和叶黄素、 β -胡萝卜素以及正己烷的标准拉曼光谱图Fig.5 The Raman spectra of tobacco samples and the standard Raman spectra of lutein, β -carotene and hexane for comparisons

从图5可以观察到, 叶黄素和β -胡萝卜素的拉曼信号主要集中在798.2~1 752.8和2 254.2~2 784.5 cm^-1这两个波段。 在PLS建模时, 分别考虑了将这两个波段分别建模和合并起来建模。 表2和表3展示了不同光谱预处理方法的结果。 从表2可以看出, 当选取798.2~1 752.8 cm^-1这个波段建立校正模型时, 叶黄素的RMSEP最小为6.68 μ g· g^-1。 而从表3可以观察到, 对于β -胡萝卜素, 当选取798.2~1 752.8和2 254.2~2 784.5 cm^-1这两个波段合并建模时, RMSEP最小为2.56 μ g· g^-1。 从图5中可以看出, 叶黄素的主要特征峰集中在798.2~1 752.8 cm^-1, 而β -胡萝卜素则主要集中在798.2~1 752.8和2 254.2~2 784.5 cm^-1。 因此, 叶黄素拉曼建模区域选择798.2~1 752.8 cm^-1, β -胡萝卜素的拉曼建模区域选择798.2~1 752.8和2 254.2~2 784.5 cm^-1是合理的。 光谱进行求导对模型的预测能力没有改善。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同的光谱预处理方法和拉曼建模区域建立的PLS模型所获得的叶黄素的预测结果 Table 2 The prediction results for lutein obtained by PLS on different pretreatment methods and Raman shift region Pretreatment LVs RMSEC /(μ g· g-1) RMSEP /(μ g· g-1) Rcali Rtest Raw data 4 6.56 7.08 0.955 0.948 798.2~1 752.8 cm-1 5 6.31 6.68 0.959 0.954 2 254.2~2 784.5 cm-1 4 6.85 7.03 0.951 0.949 798.2~1 752.8, 2 254.2~2 784.5 cm-1 5 6.10 6.94 0.961 0.951 First derivative 3 7.16 7.03 0.946 0.950 Second derivative 3 7.59 7.58 0.939 0.942 798.2~1 752.8 cm-1+First derivative 5 5.86 6.91 0.964 0.951 798.2~1 752.8 cm-1+Second derivative 3 7.62 7.56 0.939 0.942

表2 不同的光谱预处理方法和拉曼建模区域建立的PLS模型所获得的叶黄素的预测结果 Table 2 The prediction results for lutein obtained by PLS on different pretreatment methods and Raman shift region

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同的光谱预处理方法和拉曼建模区域建立的PLS模型所获得的β -胡萝卜素的预测结果 Table 3 The prediction results for β -carotene obtained by PLS on different pretreatment methods and Raman shift region Pretreatment LVs RMSEC /(μ g· g-1) RMSEP /(μ g· g-1) Rcali Rtest Raw data 9 1.45 2.84 0.983 0.945 798.2~1 752.8 cm-1 6 2.33 2.96 0.956 0.929 2 254.2~2 784.5 cm-1 4 2.61 3.13 0.945 0.914 798.2~1 752.8, 2 254.2~2 784.5 cm-1 7 1.83 2.56 0.973 0.945 First derivative 8 1.72 3.33 0.976 0.911 Second derivative 2 3.41 4.22 0.904 0.844 798.2~1 752.8, 2 254.2~2 784.5 cm-1+First derivative 5 2.55 3.26 0.947 0.907 798.2~1 752.8, 2 254.2~2 784.5 cm-1+Second derivative 2 3.42 4.27 0.903 0.841

表3 不同的光谱预处理方法和拉曼建模区域建立的PLS模型所获得的β -胡萝卜素的预测结果 Table 3 The prediction results for β -carotene obtained by PLS on different pretreatment methods and Raman shift region

在最优条件下, 即叶黄素选取的798.2~1 752.8 cm^-1波段, β -胡萝卜素选取的798.2~1 752.8和2 254.2~2 784.5 cm^-1波段, 用校正集建立PLS模型, 然后独立预测集用来预测样本。 图6和图7绘出了校正集以及独立预测集的预测浓度和参考浓度关系散点图。 从图中很明显地可以观察到, 不同的样本的预测值与参考值都相近, 表明PLS模型的建立可以准确可靠地预测烟草中叶黄素和胡萝卜素的浓度。

图6

Fig.6

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	图6 校正样本(红○)与独立预测样本(蓝+)的叶黄素浓度的预测值与参考值关系图Fig.6 Plot of the predicted values versus the reference values of calibration samples (red circle) and independent test samples (blue plus) for the concentration of lutein when the spectra were normalized by the solvent peak

图7

Fig.7

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	图7 校正样本(红○)与独立预测样本(蓝+)的β -胡萝卜素浓度的预测值与参考值关系图Fig.7 Plot of the predicted values versus the reference values of calibration samples (red circle) and independent test samples (blue plus) for the concentration of β -carotene when the spectra were normalized by the solvent peak