一个催化氧化四甲基联苯胺荧光测定超痕量铁的新方法
李丹, 梁爱惠*, 蒋治良*
广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室, 广西 桂林 541004
*通讯联系人 e-mail: zljiang@mailbox.gxnu.edu.cn; ahliang2008@163.com

作者简介: 李 丹, 1996年生, 广西师范大学环境与资源学院硕士研究生 e-mail: 244108362@qq.com

摘要

铁是一种必需的微量元素, 它在生命过程中起着重要的作用, 但是摄入过多的三价铁会使机体的载氧能力下降, 引起不稳定血红蛋白病以及高铁血红蛋白症等疾病。 无论是从人类健康还是环境保护角度出发, 探究简便、 快速、 灵敏度高和选择性好的检测Fe(Ⅲ)的分析新方法很有意义。 荧光分析是一种优异的分子光谱分析方法, 具有灵敏度高、 选择性强、 操作简单等特点, 在重金属离子的检测方面也取得了较好的进展, 目前利用荧光法测定Fe3+也有报道, 但有的灵敏度不高, 有的选择性不好, 有的试剂毒性较大。 报道了一种简单、 快速、 灵敏检测Fe(Ⅲ)的四甲基联苯胺(TMB)荧光分析新方法。 在pH 4.5 Tris-HCl缓冲液及35 ℃水浴条件下, H2O2氧化无毒易得的四甲基联苯胺(TMB)这一反应较慢; 当有痕量Fe(Ⅲ)存在时, 它催化过氧化氢(H2O2)氧化TMB生成具有较强荧光活性的TMB氧化产物(TMBox), 用激发波长280 nm激发, TMBox在405 nm处有一个较强的荧光峰, 且在一定的范围内, 随着Fe(Ⅲ)浓度的增大, 其荧光强度线性增强。 采用单变量变换法优化了荧光分析条件, 选择Tris-HCl缓冲溶液的pH为4.5, 其浓度为3.3×10-4 mol·L-1, TMB浓度为3.0×10-5 mol·L-1, H2O2浓度为6.0×10-6 mol·L-1, 在35 ℃条件下反应35 min。 在选定条件下, Fe3+浓度在0.027~400 nmol·L-1范围内, 随着Fe3+浓度的增大, 体系在405 nm处的荧光信号线性增强, 其线性方程为Δ F405 nm=2.31 c+5.0, 线性相关系数 R2为0.985, 其检出限为0.008 nmol·L-1。 考察了共存物质对测定200 nmol·L-1 Fe(Ⅲ)的影响。 结果表明, 当相对误差在±10%之内, 20 μmol·L-1的HC$O^{-}_{3}$, K+, S$O^{2-}_{4}$, N$H^{+}_{4}$, Mn2+, Na+, Cu2+, Al3+, Zn2+, F-, Mg2+, Ba2+, Ca2+, Co2+, NO3-, NO2-, 10 μmol·L-1的C$O^{2-}_{3}$, Cr6+, 2 μmol·L-1的Hg2+, BSA不干扰测定。 表明该法具有较好的选择性。 据此, 建立了一个简单、 快速、 灵敏高、 选择性高的测定Fe(Ⅲ)的荧光分析新方法。 按以下步骤制备了乳制品的样品溶液, 准确吸取1.4 mL乳制品加入600 μL乙酸( V/V=3%), 于10 000 r·min-1下离心3 min, 然后吸取离心上清液1mL加入48 μL 2.5 mol·L-1 NaOH定容至2 mL, 于10 000 r·min-1下离心3 min, 最后吸取1 mL上清液稀释至5 mL得到样品溶液。 然后采用该催化荧光分析新方法测定了牛奶样品中Fe(Ⅲ)含量, 结果令人满意, 其相对标准偏差为0.29%~0.41%, 回收率为94.6%~108.0%。

关键词: 铁离子; 催化; 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺;; 荧光
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Fluorescence Detection of Ultratrace Fe3+ Ions Based on Its Catalysis of the New Indicator Reaction between TMB and H2O2
LI Dan, LIANG Ai-hui*, JIANG Zhi-liang*
Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection(Guangxi Normal University)Ministry of Education, Guilin 541004, China
*Corresponding authors
Abstract

Iron is an essential trace element, which plays an important role in the life process, but excessive intake of ferric iron will reduce the oxygen carrying capacity of the body, causing unstable hemoglobin disease and methemoglobinosis. Whether from the point of view of human health or environmental protection, it is of great significance to explore a simple, rapid, sensitive and selective method for the determination of Fe(Ⅲ). Fluorescence analysis is an excellent method of molecular spectroscopy. It has the characteristics of high sensitivity, good selectivity and simple operation. It has also made good progress in the detection of heavy metal ions. At present, the determination of Fe3+ by fluorescence method has been reported, but some of them have low sensitivity, poor selectivity and toxicity of organic reagent. In this article, a simple, rapid and sensitive fluorescence method for the determination of Fe(Ⅲ) has been developed, using tetramethylbenzidine (TMB) fluorescence reagent. In pH 4.5 Tris-HCl buffer solution at 35 ℃, the reaction of H2O2-TMB was slow. When Fe (Ⅲ)was added, it catalyzed strongly H2O2 oxidization of TMB to form strong oxidized product TMBox with strong fluorescence. Using excited wavelength of 280 nm, TMBox exhibited a strong fluorescence peak at 405 nm, and the fluorescence intensity increased linearly with the increase of Fe(Ⅲ) concentration in a certain range. The fluorescence analysis conditions were optimized by univariate transformation. The pH of Tris-HCl buffer solution was 4.5, its concentration was 3.3×10-4 mol·L-1, the concentration of TMB was 3.0×10-5 mol·L-1, the concentration of H2O2 was 6.0×10-6 mol·L-1, and the reaction time was 35 min at 35 ℃. Under the selected conditions, the fluorescence signal of the system increased linearly at 405 nm with the increase of Fe3+ concentration in the range of 0.027~400 nmol·L-1. The linear equation is F405 nm=2.31 c+50.0, the linear correlation coefficient R2 is 0.985, and the detection limit is 0.008 nmol·L-1. According to the procedure, the influence of coexistent substances on the determination of 200 nmol·L-1 Fe3+ was tested, with a relative error of ±10%. Results indicated that 100 times HC$O^{-}_{3}$, K+, S$O^{2-}_{4}$, N$H^{+}_{4}$, Mn2+, Na+, Cu2+, Al3+, Zn2+, F-, Mg2+, Ba2+, Ca2+, Co2+, NO3-, NO2-, 50 times C$O^{2-}_{3}$, Cr6+, 10 times Hg2+, BSA did not interfere with the determination. It showed that this Fluorescence method had good selectivity. Thus, a simple, rapid, sensitive and highly selective fluorescence method for the determination of Fe (Ⅲ) was developed. Sample solution of dairy products was prepared by the following steps: accurately absorbd 1.4 mL dairy products with 600 L acetic acid ( V/V=3%), centrifugated for 3 min at 10 000 r·min-1, then took the centrifugal supernatant 1 mL with 48 L 2.5 mol·L-1 NaOH, mixed well, centrifugated for 3 min at 10 000 r·min-1, and finally piped 1 mL the supernatant, and diluted to 5 mL to get the sample solution. Then the new catalytic fluorescence method was used to determine the content of Fe(Ⅲ) in milk samples, with satisfactory results. The relative standard deviation was 0.29%~0.41%, and the recovery was 94.6%~108.0%.

Keyword: Iron ion; Catalysis; 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine;; Fluorescence
引 言

铁是一种必需的微量元素, 它在生命过程中起着重要的作用, 但是摄入过多的三价铁会使机体的载氧能力下降, 引起不稳定血红蛋白病以及高铁血红蛋白症等疾病[1]。 因此, 定量测定Fe(Ⅲ )的浓度越来越受到重视。 目前测定Fe3+的方法主要有荧光法、 比色法、 原子吸收法等[2, 3, 4, 5, 6, 7]。 原子吸收法选择性好, 但仪器价格较贵。 Alikhani[5]等以4, 5-二羟基-1, 3-苯二磺酸为络合剂与Fe3+生成络合物, 利用分散液微萃取技术进行萃取, 用原子吸收光谱可检测3.5× 10-7~5.4× 10-6 mol· L-1 Fe3+。 光度法具有仪器价廉、 简便等特点, 但灵敏度不高。 Buduru[6]等以草氨酸(OA)和对氨基苯甲酸(PABA)功能化的金纳米粒子(OAPABA-AuNPs)作为探针, 比色法检测1.0× 10-5~4.0× 10-4 mol· L-1 Fe3+。 Chen[8]等合成掺硼石墨烯量子点(BGQDs)作为荧光探针, 利用荧光法检测1.0× 10-8~1.0× 10-4 mol· L-1 Fe3+。 Mauro[9]等基于六氰合铁酸钌制备碳纤维微电极, 利用安培法定量测定1.0× 10-5~2.1× 10-4 mol· L-1 Fe3+

荧光分析是一种分子光谱分析方法, 具有灵敏度高、 选择性强、 操作简单等特点[10], 在重金属离子的检测方面也取得了较大的进展。 Hu[11]等利用水热法合成新型层状二硫化钼(MoS2)纳米片用于催化H2O2氧化邻苯二胺(OPD)生成高荧光物质2-氨基-3-羟基吩嗪(DAPN), 在Fe2+存在下MoS2纳米片的催化活性大大增强, 据此建立了一个荧光法检测Fe2+的方法, 其检测范围是5.0× 10-9~2.0× 10-7 mol· L-1, 检出限为3.5× 10-9 mol· L-1。 目前利用荧光法测定Fe3+已经较为成熟, 但是未见利用催化氧化TMB荧光法测定Fe3+的报道。 Xu[12]等利用水热法合成掺铜碳点(Cu-CDs)用作荧光探针, 据此建立了一个荧光法测定Fe3+的方法, 其检测范围是1.0× 10-9~2.0× 10-4 mol· L-1, 检出限为1.0× 10-9 mol· L-1。 Zhao[13]等开发了一种灵敏的荧光化学传感器Tyloxapol(水溶性荧光低聚物)对Fe3+进行检测, 该法表现出了较高的灵敏度和选择性, 其检测范围是0~1.0× 10-4 mol· L-1, 检出限为2.2× 10-6 mol· L-1。 3, 3’ , 5, 5’ -四甲基联苯胺(TMB)是一种常用的氧化还原显色剂, 已用于光度分析[14]。 用TMB可做检测Fe(Ⅲ )的显色剂[15], 其线性范围为1.0× 10-7~1.5× 10-4 mol· L-1, 检出限为5.5× 10-8 mol· L-1。 目前, 虽有荧光法检测铁的报道, 但大多是利用荧光猝灭作用, 尚未见基于痕量Fe(Ⅲ )催化氧化TMB生成荧光产物TMBox, 用来检测Fe(Ⅲ )的荧光法报道。 本文利用TMBox这一新的荧光反应, 建立了检测牛奶中Fe(Ⅲ )的荧光新方法, 具有试剂易得、 无毒、 简单、 快速、 选择性好、 灵敏度高等优点。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

日立F-7000荧光分光光度计(日立高新技术公司); HH-S2电热恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂); SYZ-550型石英亚沸蒸馏水器(江苏晶玻仪器厂); pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。 1.0 mmol· L-1氯化铁(广东汕头市西陇化工厂)储备液; 0.5 mmol· L-1 3, 3’ , 5, 5’ -四甲基联苯胺(TMB, 储存: 2~8 ℃, T81849 3~5 g, CAS: 54827-17-7, 上海麦克林生化科技有限公司): 称取0.012 g四甲基联苯胺, 溶于100 mL乙醇溶液(乙醇:水=1:1)中。 1.0× 10-4 mol· L-1 H2O2配制: 取100 μ L 30% H2O2于10 mL离心管, 用水定容至10 mL, 浓度为0.1 mol· L-1, 使用时用水逐级稀释至1.0× 10-4 mol· L-1。 pH 4.5 Tris-HCl缓冲液: 10 mL离心管中加入500 μ L 0.1 mol· L-1 Tris溶液与505 μ L 0.1 mol· L-1 HCl溶液, 充分混合, 随后定容至10 mL。 溶液所用试剂均为分析纯级, 实验用水为亚沸水。

牛奶样品的处理: 自某大型超市购得三种不同的奶样品, 准确吸取1.4 mL三种乳制品加入600 μ L乙酸(V/V=3%), 于10 000 r· min-1下离心3 min, 然后吸取离心上清液1 mL加入48 μ L NaOH(2.5 mol· L-1)定容至2 mL于10 000 r· min-1下离心3 min, 最后吸取1 mL上清液稀释至5 mL得到样品检测液[16]

1.2 方法

在5.0 mL的刻度试管中, 依次移取90 μ L 5× 10-4 mol· L-1 TMB, 100 μ L 5.1 mmol· L-1(浓度以HCl计)Tris-HCl缓冲液, 90 μ L 1.0× 10-4 mol· L-1 H2O2溶液, 一定浓度的FeCl3溶液, 定容至1.5 mL, 混匀。 35 ℃下水浴35 min后, 冰水冷却至室温。 取溶液于石英皿内, 在volt=350 V, excited slit=emission slit=5 nm, excitation wavelength=280 nm条件下, 用荧光分光光度计扫描, 获得荧光光谱; 不加Fe3+做空白, 测定其荧光峰值为(F405 nm)0, 计算Δ F=F405 nm-(F405 nm)0

2 结果与讨论

在pH 4.5 Tris-HCl缓冲溶液条件下, Fe(Ⅲ )对H2O2/TMB生成TMB氧化产物TMBox的反应具有较强的催化作用。 TMB的氧化产物TMBox具有荧光效应, 在一定的范围内, 随着Fe(Ⅲ )浓度的增大, 生成的TMBox越多, 溶液颜色由无色变为浅蓝色, 405 nm处的荧光峰线性增强。 据此可以建立一个荧光测定Fe(Ⅲ )的新方法(图1)。

图1 催化荧光测定Fe3+的分析原理Fig.1 Scheme of catalytic fluoresce detection of Fe3+

2.1 荧光光谱

荧光分光光度计电压为350 V, 狭缝为5.0 nm, 固定荧光波长为405 nm, 激发波长从200~700 nm扫描获得激发光谱。 TMBox分别在240和280 nm处产生2个激发光谱峰, 且随着Fe(Ⅲ )浓度升高, 其激发光谱信号逐渐增强。 当选用280 nm为激发波长时, 体系的405 nm处的荧光信号最强, 故选择280 nm作为激发波长。 按实验方法进行Fe(Ⅲ )检测, 在一定的范围内, 随着Fe(Ⅲ )浓度增大, 体系荧光信号线性增强(图2)。

图2 TMB-Fe3+-Tris-HCl-H2O2体系荧光光谱
Fe3+浓度分别是0, 2.7× 10-11, 2.8× 10-8, 8.0× 10-8, 1.6× 10-7, 2.4× 10-7, 3.2× 10-7, 4.0× 10-7 mol· L-1
Fig.2 Fluorescence spectra of the TMB-Fe3+- Tris-HCl-H2O2 system
The Fe3+ concentrations are 0, 2.7× 10-11, 2.8× 10-8, 8.0× 10-8, 1.6× 10-7, 2.4× 10-7, 3.2× 10-7 and 4.0× 10-7 mol· L-1 respectively

2.2 条件优化

考察了Tris-HCl缓冲溶液pH对体系荧光信号的影响。 实验结果表明, 选择Tris-HCl溶液的pH为4.5, 其Δ F最大。 实验考察了Tris-HCl缓冲溶液浓度对体系Δ F的影响, 当Tris-HCl溶液浓度为3.3× 10-4 mol· L-1时, Δ F最大, 故选用Tris-HCl溶液浓度为3.3× 10-4 mol· L-1。 实验考察了TMB浓度对体系Δ F的影响, 当TMB浓度为3.0× 10-5 mol· L-1时, Δ F最大, 故选用TMB浓度为3.0× 10-5 mol· L-1。 实验考察了H2O2浓度对体系Δ F的影响, 当H2O2浓度为6.0× 10-6 mol· L-1时, Δ F最大, 故选用H2O2浓度为6.0× 10-6 mol· L-1。 实验考察了反应温度对体系Δ F的影响, 当反应温度为35 ℃时, Δ F最大, 故选择35 ℃作为体系反应温度。 实验考察了反应时间对体系Δ F的影响, 结果表明, 当水浴时间为35 min时Δ F达到最大, 故选用35 min作为反应时间。

2.3 工作曲线

按照实验方法绘制了体系的工作曲线。 随着Fe3+浓度的增加, 生成的TMBox越多, 体系的Δ F值线性增大, 在0.027~400 nmol· L-1 Fe3+浓度范围内, F405 nm处的荧光强度变化Δ F与Fe3+浓度呈良好的线性关系, 线性方程为Δ F405 nm=2.31c+5.0, 线性相关系数R2为0.985, 检出限(3σ )为0.008 nmol· L-1 Fe3+

2.4 共存物质的影响

按实验方法, 考察了常见共存的物质对TMB-Fe3+-Tris-HCl-H2O2体系荧光测定0.2 μ mol· L-1 Fe(Ⅲ )的干扰情况。 表1表明, 当相对误差在± 10%内, 100倍的HC O3-, K+, S O42-, N H4+, Mn2+, Na+, Cu2+, Al3+, Zn2+, F-, Mg2+, Ba2+, Ca2+, Co2+, NO3-, NO2-, 50倍的C O32-, Cr6+, 10倍的Hg2+, BSA不干扰测定。 说明该法具有较好的选择性。

表1 干扰离子对荧光体系的影响 Table 1 Effect of interfering ions on fluorescence system
2.5 样品分析

奶样品购自某大型超市, 样品处理见1.1节, 以不加样品检测液为空白, 按实验方法对Fe3+浓度进行检测, 结果见表2。 相对标准偏差在0.29%~0.41%之间, 回收率在95%~105%之间。

表2 样品分析结果 Table 2 Samples analysis results
3 结 论

在pH 4.5的Tris-HCl缓冲溶液下, Fe3+催化氧化3, 3’ , 5, 5’ -四甲基联苯胺(TMB)生成的氧化产物具有荧光效应。 在选定的条件下, Fe3+浓度与荧光强度之间存在良好的线性关系, 据此建立了灵敏、 简便、 快速检测0.027~400 nmol· L-1 Fe(Ⅲ )的荧光分析方法。 该法用于测定牛奶样品中Fe3+含量, 结果令人满意。

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