红外光谱是基于分子或者基团的振动和转动而产生的光谱, 因而可以根据光谱的特征来确定样品的组分、 性质、 结构及含量。 由于绝大多数有机物和无机物的基频吸收带都出现在中红外区(4 000~400 cm^-1)而倍频和合频出现在近红外区(13 333~4 000 cm^-1), 因而对应两个光谱波段的中红外光谱(mid-infrared spectroscopy, MIRS)和近红外反射光谱(near-infrared reflectance spectroscopy, NIRS)是研究和应用最多的两种红外光谱检测分析技术^[16]。 在测量方式上, 可以分为光栅分光得到的红外光谱和通过傅里叶变换得到的红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy: FTIR spectroscopy)。 与常规检测技术相比, 红外光谱检测技术具有如下优点(如表1所示): (1)它是一种无损检测技术, 不会对生物样品造成损害, 因而可以用于生物活体测量; (2)它灵敏度较高, 可以实现单细胞个体的原位和无损检测^[17]; (3)它可以对生物样品中多种化学成分同时进行分析; (4)中红外波长较短, 结合现代显微成像技术, 空间分辨率可达2~3 μ m, 可以实现微观空间的观测; (5)对样品前处理要求不高, 测量操作简单易行^[18]。

特别是红外光谱结合化学计量学的分析方法, 已经在生物学领域有着广泛的应用。 比如在微生物的鉴定和分类方面, Grunert等^[19]基于人工神经网络(artificial neural network, ANN)的算法对荚膜型金黄色葡萄球菌致病菌进行区分, 其识别准确率高达98.2%; 在生物的生长代谢研究中, Saharan等^[20]利用红外光谱结合常规生化检测对酒精胁迫下的酵母的生长状况进行了分析, 表明通过此类方法可以实现细胞内糖类、 脂类和蛋白等成分变化的快速和高效观测。 雨生红球藻是一种单细胞的绿藻其细胞主要由类胡萝卜素(β -胡萝卜素和虾青素)、 脂类、 蛋白质、 多糖等几类组分构成, 利用中红外和近红外光谱可以对微藻(雨生红球藻)进行快速分析。 图1显示, 我们利用MIRS和NIRS可以实现对不同种类微藻的快速区分和多种组分的无损检测^{[21, 22]}。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 在生物样品分析中红外光谱与其他检测手段的技术特点比较 Table 1 The characteristic comparison between infrared spectroscopy and other measurement methods in biological sample analysis 检测手段 准确度 通量 检测成本 空间原位 多组分 红外光谱技术 较高 快 低 是 是 气(液)相 高 慢 较高 否 否 分光光度法 低 较慢 低 否 否 生化分子技术 高 慢 高 是 否

表1 在生物样品分析中红外光谱与其他检测手段的技术特点比较 Table 1 The characteristic comparison between infrared spectroscopy and other measurement methods in biological sample analysis

传统的组织学方法主要依赖于光学或电子显微镜对细胞或组织样品形貌特征进行检测, 对微区域的化学组成分析时还需要进行染色或标记, 操作步骤复杂并且只能分析少数特定几类组分。 红外显微光谱及成像可以有效的解决以上问题。 红外显微光谱是将显微镜和红外光谱检测两者的优势相结合, 可以实现样品特定微区红外光谱信号的测量和采集, 得到微观空间上某一位点的物质结构和化学组成信息^[23]。 特别是红外光谱显微成像, 使得光谱检测技术能够在微观尺度上对样品进行检测和分析, 从单细胞、 组织和个体水平上研究组分含量的变化^[24]。 目前红外光谱成像可以分为两种: 一种是依靠载物台逐点移动对样品某一区域进行单通道的光谱信息采集, 然后再进行点对点的化学成像^[25]; 另一种是1995年发展起来的焦平面阵列检测技术(focal plane array, FPA), 它将显微光谱检测与焦平面阵列检测器相结合从而不需要借助载物台的移动即可实现特定区域的多通道快速扫描, 很大程度上减少了样品红外成像检测的时间^[26]。

最近, 研究人员进一步发展了基于同步辐射的红外光谱技术。 同步辐射(synchrotron radiation)光源具有辐射强度高、 单色性好、 准直性高、 光谱连续且范围宽等优点, 为红外光谱提供了质量更好、 亮度更高(常规光源的100~1 000倍)的光源, 使得红外光谱及成像的空间分辨率能够达到2~3 μ m, 且信噪比(S/N)显著提高, 解决了传统热光源无法实现的高空间分辨率和高质量光谱快速测量的问题^{[27, 28, 29]}。 正是基于同步辐射光源的红外光谱的独特优势, 此项技术已经被逐步用于在显微水平对生物体的生长、 代谢、 辐射、 毒理等方面的研究^{[30, 31, 32, 33, 34, 35, 36]}。 目前显微红外光谱及成像技术应用于微藻的研究正处在起步阶段, 相关文献不多, 主要集中于微藻生理代谢的研究。 比如美国的Hirschmugl教授的研究小组利用基于同步辐射的红外光谱成像对威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)的细胞进行的检测, 可以观测到不同浓度CO₂生长条件下藻细胞中脂类、 蛋白和多糖含量的差异^{[37, 38]}; Wetzel等^[39]利用红外光谱成像结合同位素标记的方法研究了刚毛藻(Cladophora glomerata)对氮元素的吸收与细胞内脂类、 蛋白和多糖的关系。 在这一方面我们也做了一些探索性的工作。 例如, 利用Bruker 66v/s Fourier变换光谱仪我们对培养20天的雨生红球藻不同突变株细胞中的各组分进行了红外成像, 其空间分辨率能够达到2 μ m。 如图2所示, 细胞中类胡萝卜素(3 010 cm^-1)的光谱信号强度和空间分布与脂质(1 740 cm^-1)相一致, 这是因为脂质参与了虾青素的转运和贮存, 两者的含量和空间分布有很大的相关性。 特别是在M3突变藻株中, 其细胞内的蛋白质、 脂类和多糖的MIRS信号强度明显高于出发株, 而这些成分的提高都有助于雨生红球藻细胞内虾青素的积累。 因此, 利用此项技术可以实现高产虾青素雨生红球藻突变株的早期快速筛选^[21]。

图1

Fig.1

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图1 (a)野生型(WT)和M3, M14突变型雨生红球藻株各组分的中红外光谱(3 010 cm-1 C=C的伸缩振动, 1 650和1 550 cm-1主要来自为蛋白质Amide Ⅰ 和Amide Ⅱ 振动及部分类胡萝卜素分子的振动); (b)基于红外光谱的主成分分析; (c)野生型(WT)和M3, M33突变型藻株各组分的近红外光谱; (d)基于近红外光谱数据模型对虾青素(AXT)与细胞干重(DW)含量比例的预测[21, 22]Fig.1 (a) MIRS for wild-type (WT) Haematococcus pluvialis and the mutants M3 and M14 (the 3 010 cm-1 band is ascribed to C=C stretching mode, 1 650 and 1 550 cm-1 bands are ascribed to Amide Ⅰ and Amide Ⅱ of proteins and vibration of carotenoid molecules as well); (b) and principal component analysis (PCA)based on MIR data; (c) NIRS for WT Haematococcus pluvialisand and the mutants M3 and M33; (d) Prediction of astaxanthin (AXT) as a percentage of DW (dry weight) in Haematococcus pluvialis[21, 22]

红外光谱可用于藻类鉴别, 即对各种藻种进行红外光谱测量, 对得到的红外光谱数据进行统计学处理, 结合不同的化学计量学方法进行分析。 常用的方法有: 主成分分析(principal component analysis, PCA), 判别分析(discriminant analysis, DA), 偏最小二乘法(partial least-squares, PLS), 分级聚类分析(hierarchical cluster analysis, HCA), 人工神经网络法(ANN)。 结合以上分析方法, 红外光谱在微藻的鉴定、 判别和分类中具有广泛的应用前景。 比如, Duygu等^[40]利用红外光谱对小球藻和栅藻检测并利用其组分的差异实现了两类微藻的快速区分。 Laurens和Wolfrum^[41]利用PCA方法对不同种属的硅藻、 绿球藻和螺旋藻的NIRS和FT-IRS检测结果进行分析, 发现根据细胞内油脂、 色素等成分的含量差异可以很好地实现微藻区分。 Kansiz等^[42]利用SIMCA和KNN两类化学计量学方法对几株不同蓝藻的光谱数据分析结果表明红外光谱可以很有效的用于微藻的分类鉴定。

传统的组分含量的测定(比如液相和气相分析)需要经过细胞的破碎、 分离、 提取等繁琐的步骤, 而且每次只能进行单一或少量几种成分的分析, 而光谱可以实现样品原位、 无损的定量检测, 因而光谱技术已经被逐步应用于藻体生物量、 成分的定量分析研究中。 Pelusi等^[43]对不同株的定鞭金藻的中红外光谱检测并与气相色谱检测结果相比较, 发现归属于反式— C=C— 的962.5 cm^-1的光谱吸收带的强度能够很好反应藻细胞中长链烯酮的含量, 因而应用此技术可以很好地实现烯酮动态分布与细胞代谢调控关系的研究。

图2

Fig.2

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图2 野生型(WT)和突变藻株各组分的红外光谱显微成像(空间分辨大约4 μ m): 3 010 cm-1的光谱信号对应于类胡萝卜素C=C的成像; 2 925 cm-1对应于脂质中CH3和CH2伸缩振动的成像; 1 740 cm-1对应于脂质中C=O的成像, 1 650 cm-1主要对应于蛋白质Amide Ⅰ 的成像; 1 035 cm-1主要对应于藻细胞中多糖的分布成像[21]Fig.2 Chemical mappings for different components in the wild-type (WT) and mutant Haematococcus pluvialis cells (spatial resolution about 4 μ m): map for C=C at the absorption band around 3 010 cm-1; map for lipids at stretching of CH3 and CH2 around 2 925 cm-1; map for C=O at the absorption band around 1 740 cm-1; map for proteins at stretching of Amide Ⅰ around 1 650 cm-1; map for carbohydrates at the absorption band around 1 035 cm-1[21]

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 红外光谱在不同微藻研究领域的应用Fig.3 The application of infrared spectroscopy in different microalgal research fields

与其他的光谱检测技术相比较, 近红外光谱具有检测更加快速并且不受水分影响的优势^[15]。 现在应用NIRS技术进行微藻的代谢监测和高产藻株的快速分选已经发展为一种趋势。 比如, Brown等^[13]对产油脂微藻的油脂、 生物量进行了NIRS和生化检测, 并进一步构建模型对不同时期微藻中的油脂含量进行测定。

随着生长时期和环境条件(营养、 光照、 温度、 pH等)的变化, 藻细胞内脂类、 蛋白、 核酸、 多糖等成分的含量和空间分布会出现明显的差异, 因而对这些组分的实时动态监测可以很好地掌握藻类的生长状况, 尤其在规模化生产养殖中具有重要的指导意义。 正是基于红外光谱区别于传统检测分析技术的独特优势, 此项技术已经开始逐步应用到微藻的生长代谢研究中。 自2001年Giordano 等^[44]将红外光谱应用到真核微藻的研究, 在接下来的十多年的藻类生物学的研究领域此项技术已经作为一种常用技术应用于微藻生长速率的监测、 营养条件与生理等藻类生长代谢过程的研究。 Stehfest 等^[45]利用红外光谱对营养条件不同的多种浮游藻类检测发现藻类既可以通过色素形成和光合作用效率的变化在短时期内适应环境的变化, 还可以通过组分和代谢的改变进行长期的适应, 并且不同藻株之间对环境的适应能力的大小具有种属的特异性。 Heraud等^[46]利用红外光谱成像的方法对营养胁迫条件下的小星藻(Micrasterias hardyi)进行动态观测, 可以在显微空间水平上观测到脂类、 蛋白等组分在细胞核和叶绿体的分布。 进一步研究发现, 在氮素缺乏的藻株中重新提供氮源后藻细胞内尤其是叶绿体位置脂类含量明显提高: 1 750~1 720 cm^-1脂类的 C＝O位置红外吸收峰强度由0.34增加至0.59; 而磷元素的缺乏对细胞中蛋白质含量影响较小: 1 565~1 515 cm^-1蛋白质的Amide Ⅱ 的红外吸收峰强度稳定在0.22与0.27之间。 Mecozzi 等^[47]还利用NIRS和FT-IRS两种红外光谱对不同培养条件下的产毒素海藻进行了分析, 研究发现生理环境可以诱导藻细胞内蛋白质二级结构的转变以及藻细胞内脂类、 多糖等组分的差异, 而这些变化与藻毒素的产生密切相关。

尤其随着红外光谱成像技术的发展, 可以在单一藻细胞中观测各组分显微空间水平上的变化。 Nasse等^[48]利用显微红外光谱成像技术对单个活体小星藻检测, 可以看到同时期的藻细胞脂类、 蛋白、 糖类等组分的空间位置含量和分布的差异。 Hirschmugl等^[49]基于同步辐射的红外光谱显微成像技术并结合分级聚类分析(HCA)方法研究发现可以实现对不同营养状态下的纤细角毛藻(Euglena gracilis)的快速区分。

自然界中的微藻在长期的进化过程中形成了自身一套完整的代谢调控机制。 它们可以通过体内的反馈抑制、 阻遏等各种机制来调控自身的生长和初(次)级代谢产物合成, 这样就保证底物不会因为过度消耗而造成对环境营养的“ 浪费” 。 这就使得从自然界分离得到的野生藻株在产量和质量上很难达到规模化工业生产的需求, 而在微藻的规模化生产养殖中要取得较高的效益就必须要有优良的生产藻株。 因而藻株改良技术的进步是微藻产业取得良好经济效益的技术保证。

微藻的育种内容涉及范围非常广泛, 主要包括野生型藻种的基因突变和高产藻株的筛选两个部分。 目前, 藻种的改良主要通过物理、 化学、 生物的手段对野生型的藻株进行处理得到遗传性状良好的突变体, 此项诱变技术已经十分完善和成熟。 然而, 如何能够快速高效地从大量的突变体中筛选得到高产的突变藻株是一个亟待解决的问题。 在传统的筛选方法中, 首先是将经过诱变后的藻株涂平板培养形成藻落, 然后挑取藻落进行扩大培养, 最后进行生理生化的测定获得生长速率和单位产量较高的藻株。 然而, 此类方法操作步骤繁琐、 实验周期长并需要多种昂贵的精密仪器, 很难达到快速高通量筛选的要求^{[50, 51, 52, 53]}。 实际上, 把简单快速的光谱检测应用于筛选已经成为一个研究热点和发展趋势。 比如, Meanwell等^[54]利用FTIR光谱筛选获得了链霉素高产突变菌株, Morita等^[55]应用NIRS对木糖发酵的酵母混合菌株进行高通量筛选。 在藻类的筛选育种中, 我们在雨生红球藻的研究中发现利用红外结合拉曼显微光谱及成像技术可以很好的对虾青素、 β 胡萝卜素、 蛋白质、 脂类和多糖的含量和空间分布进行快速定量分析, 由此建立了高产虾青素雨生红球藻突变株的快速筛选方法^{[21, 22]}。 Brown等^[13]对产油脂微藻的油脂、 生物量进行了NIRS和生化检测, 并进一步构建模型对不同时期微藻中的油脂含量进行测定。

微藻是工业废水和生活污水中重金属和有机染料的有效吸附剂, 对于环境污染物的去除具有重要的应用价值, 但是对于其具体的吸附和降解的机理机制还不是很清楚。 Dotto等^[56]利用红外光谱对吸附染料后的螺旋藻进行检测分析, 发现OH的峰位由3 370 cm^-1移动到3 358 cm^-1并且蛋白质的Amide Ⅲ 的吸收峰由1 320 cm^-1移动到了1 365 cm^-1, 这些变化主要与染料和螺旋藻细胞中的OH, Amide Ⅲ 等基团的结合有关。 Doshi等^[57]利用红外光谱对吸附Ni²⁺, Cr³⁺, Cu²⁺和Cr₂ O72-不同金属离子的螺旋藻研究分析发现, 其磷酸、 羟基和多糖等藻类组分中的基团参与了离子吸附。 Finocchio等^[58]利用盐酸和甲醇对螺旋藻粉进行甲基化处理, 发现经过甲基化的藻粉对Cr(Ⅵ )有很好的吸附性能; 而利用红外光谱分析藻样中CH, COO— 等基团的变化可以用来评价藻细胞甲基化的效率。 El-Sheekh等^[59]将小球藻、 念珠藻、 团藻等几类微藻与工业废水中偶氮染料进行共培养发现微藻可以利用自身的酶类降解有机染料并且去除率高达95%, 他们利用红外光谱对与染料共培养前后的藻体进行分析进一步阐释了微藻降解有机染料的机理。

此外, 微藻作为水环境中的重要群体还可以用于进行水生生态系统的评估。 Patel等^[60]利用红外光谱成像研究发现经过甲芬那酸、 美托洛尔和普萘洛尔三种常见的水体残留药物处理后的小星藻细胞内蛋白质的合成得到了显著的抑制, 同时在普萘洛尔处理组脂质含量显著降低, 从而解释了低浓度的普萘洛尔对藻细胞损伤作用最大的原因。

微藻细胞内的天然活性成分对人体具有很好的营养和医疗价值, 因而越来越多的微藻资源被开发用于功能性食品和药品的生产。 多数微藻制品的加工和生产过程比较复杂导致其生产成本显著提高; 特别是有些生产商会通过一些低成本的添加剂来取代藻类成分; 还有一些微藻产品存在变质、 重金属超标等问题, 使得更多消费者和生产商更加关注微藻制品的食用安全问题^{[61, 62]}。 然而, 常规的检测分析技术步骤繁琐、 耗时较长, 给食品和医药的监管带来了难度, 进一步促使具有快速高效和无损检测优势的光谱技术逐步应用到该领域。 比如, Wu等^[63]首次利用NIRS对螺旋藻藻粉中两类常用添加剂— 面粉和绿豆粉的含量进行了检测和分析, 表明基于LS-SVM模型的NIRS检测技术可以很好地预测藻粉中添加剂的成分和含量。 刘海静等^[64]利用红外光谱对天然螺旋藻、 螺旋藻粉和螺旋藻片的成分进行分析, 建立了一种螺旋藻产品品质检测和真伪鉴别的高效、 快速分析方法。