1928年印度物理学家Raman发现了拉曼散射现象^{[16, 17]}, 拉曼光谱作为一种分子光谱技术可快速获取目标分析物的“ 指纹图谱” ^[18]。 1974年Fleischmann等将吡啶吸附于粗糙银电极表面首次观测到拉曼增强信号^[19]。 1977年Van Duyne研究组^[20]和Creighton研究组^[21]都经过系统的实验研究和理论计算, 将这种与银、 金、 铜等粗糙表面相关的增强效应称为表面增强拉曼散射效应。 当分子吸附于粗糙金属表面时, 拉曼光谱信号能被放大10⁶~10^14[22-23], 这使SERS进行单分子检测成为可能^{[24, 25]}, 而且SERS具有不受水分干扰的优势, 因此可用于食源性微生物的检测分析^[26]。

SERS增强效应理论主要为电磁增强和化学增强^{[27, 28]}。 电磁增强由局部等离子共振所产生^{[29, 30]}, 而化学增强由吸附分子与金属纳米材料接触产生电荷转移而造成^{[31, 32]}。 已有研究表明, 电磁增强因子取决于等离子材料结构, 理论计算增强因子可达10¹⁰~10¹¹, 化学增强因子达10^3[33], 电磁增强为拉曼信号增强提供主要贡献, 化学增强在特定情况下与电磁增强同时发生, 使拉曼增强效应达到最大。 目前电磁化学增强是较为公认的拉曼增强理论, 在实际应用中的作用机制仍然需要开展深入的基础理论研究。

目标分子吸附于金属纳米活性基底表面, 形成热点, 因电磁及化学增强, 获得SERS信号, 因此纳米基底是拉曼增强的关键。 针对不同分析物, 制备不同材料, 结构, 形态的纳米增强基底也成为国内外学者研究的热点之一。 根据基底形态大致可分为三种: (1)纳米颗粒溶胶, 常用的有金、 银及核壳结构复合纳米粒子溶胶^{[34, 35]}, (2)金属纳米材料固定排列于固体底板, 通常为金、 银纳米颗粒或纳米棒等材料固定于玻璃片或硅片^{[34, 36]}; (3)采用模板或刻蚀等方法制备形状大小可控的金属薄膜等纳米材料用于SERS分析^{[37, 38]}。 不同基底针对不同分析物展现了各自的优势, 但也存在各自的缺点, 如纳米溶胶基底容易制备获得, 但其稳定性有待改进, 固体基底的稳定性、 一致性及可控性较高, 但制备过程较为复杂, 同样存在对目标分析物的选择性问题, 为适应不同分析需求, 纳米基底多样性、 特异性、 灵敏性等也受到研究人员的重视和关注。

SERS在食品安全分析中, 不仅可用于化学危害物的检测分析, 在食源性微生物检测中也得到应用, 相关研究报道不断增多^{[39, 40]}。 常见的食源性致病微生物有沙门氏菌、 葡萄球菌、 副溶血性弧菌、 大肠杆菌、 变形杆菌、 李斯特菌等, 国内外学者采用不同纳米基底对致病微生物进行了SERS检测研究。

目前大多数研究并未对食品样品进行分析, 对标准微生物的实验研究表明了SERS用于快速、 灵敏检测食源性微生物的可行性。 Lin等^[41]通过银镜反应将银纳米粒子沉积于滤纸上作为SERS增强基底对沙门氏菌、 不动杆菌和克雷伯氏杆菌进行了检测, 对三种菌判别正确率为100%。 Fan等^[42]采用一种硅晶片沉积金纳米粒子固体基底(Klarite^TM)对诺瓦克病毒等7种食源性或水源性病毒菌株进行了SERS检测鉴别, 采用SIMCA(soft independent modeling of class analogy)对包膜与未包膜病毒样品的识别率超过了95%。 Sundaram等^[43]在聚乙烯醇微球表面沉积银层, 银壳高聚物微球覆盖于云母板干燥后作为SERS基底, 对从禽类和猪生理单元分离的鼠伤寒沙门氏菌、 致病大肠杆菌、 单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌进行了分析, 采用主成分分析(principal component analysis, PCA)建立了判别模型, 判别正确率达到99%, 进一步采用SIMCA对未知样品进行验证, 正确率为97%。

研究人员通过对基底功能化处理, 以期提高SERS分析的灵敏性。 Sengupta等^[44]采用肽功能化的金纳米粒子绑定单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌, 进行了SERS检测, 研究表明不同目标细菌需要不同生物标记肽进行功能化后与基底连接后检测。 Wu等^[45]采用斜角沉积技术在玻璃片上沉积银纳米棒经万古霉素功能化处理, 对来源于12个种类的27种不同细菌进行了定性识别分析, 基于细胞壁不同结构, SERS光谱对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的正确识别率为100%。 基于功能化银纳米棒进一步对沙门氏菌、 大肠杆菌O157: H7和表皮葡萄球菌进行了SERS检测, 采用便携式或手持式拉曼系统对绿豆芽中食源性微生物的最低检出浓度为100 CFU· mL^{-1 [46]}。 Chen等^[47]同样采用斜角沉积技术制备银纳米棒, 采用DNA适配体修饰后绑定鼠伤寒沙门氏菌进行SERS检测, 采用PCA可将鼠伤寒沙门氏菌从其他菌种有效区分, 该方法的局限是检出限为10⁸ CFU· mL^-1, 重复性也有待提升。 Wang等^[48]制备了一种三维可控等离子纳米盘可有效聚集细菌的超晶体基底, 经万古霉素修饰后可固定目标细菌, 可准确识别芬达饮料中大肠杆菌和木糖葡萄球菌。 已有实验表明功能化处理SERS基底不同方法存在较大差异, 需要进一步优化以提高其实际应用潜力。

SERS无标记识别因操作简单, 可实现快速分析而受到关注。 Xie等^[49]采用金纳米溶胶基底结合SERS对肠杆菌科7种微生物进行了检测, 不同微生物与纳米溶胶基底混合后实现了SERS无标记识别。 而Chen等^[50]在细菌细胞培养液中合成了银纳米颗粒溶胶结合SERS成功无标记识别了大肠杆菌、 绿脓杆菌、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和李斯特菌, 并进一步鉴别了两种不同的李斯特菌, 以无害李斯特菌为样品代表, 该方法的最低检测限为10³ CFU· mL^-1, 分析时间在5 min之内。 而采用抗体标记基底可实现准确捕获目标物, 提高分析准确性。 Li等^[51]利用SERS对饮用水中的不动杆菌和大肠杆菌进行了检测, 基于银包裹磁性纳米粒子(Ag@MNPs)作为基底, 可实现致病菌有效捕获, 在15 min内可对水样中的细菌实现高灵敏检测(10⁵ CFU· mL^-1)。 Najafi等^[52]制备了Fe₃O₄磁性粒子表面包裹金纳米粒子, 形成核壳结构的免疫磁珠, 通过抗体标记后用于大肠杆菌O157: H7的免疫分离SERS检测。 以苹果汁作为食品模型, 对目标微生物捕获效率约为84%~95%, 对苹果汁中大肠杆菌O157: H7的最低检出浓度为10² CFU· mL^-1, 分析时间不超过1 h。 副溶血性弧菌是常见的食物中毒病原菌之一, Yao等^[53]研究人员开发了一种抗体-VP-适配体夹层结构经过Au@Ag纳米颗粒标记结合体外恒温核酸扩展实现SERS信号增强, 对副溶血性弧菌最低检出限为1 CFU· mL^-1。 进一步对水样中添加不同浓度的副溶血性弧菌进行了检测, 回收率为95%~107%。 研究结果表明该方法具高特异性, 稳定性和灵敏度。 采用DNA序列扩增与SERS联用技术检测微生物是比较新的研究报道。 Draz等^[54]采用恒温扩增技术与SERS联用检测肠炎沙门氏菌。 目标细菌DNA经恒温扩增后放大, 被特殊DNA修饰的金纳米探针标记用于SERS检测。 其结果展现出高特异性和高灵敏性(66 CFU· mL^-1)。 采用该方法可获得牛奶中浓度为6× 10³ CFU· mL^-1肠炎沙门氏菌的SERS信号。

Witkowska等^[55] 采用电化学方法将银纳米粒子沉积于FTO镀膜玻璃板作为SERS基底, SERS结合PCA检测了5种不同食品基质(三文鱼、 火腿、 鸡蛋、 婴幼儿配方奶粉和混合香料)中的沙门氏菌、 单增李斯特菌和阪崎肠杆菌, 以期SERS方法可作为传统方法的有效的替代成为ISO分析标准。 SERS对5种食品样品中3种病原菌的正确判别率为98%, 分析时间由6天缩短为2天, SERS可作为强有力的微生物分析工具用于食品工业中。 该研究是极少数利用SERS对不同食源性病原菌在多种食品中进行检测的报道, 说明了SERS技术用于食品中微生物检测的极大潜力和前景, 表1为食品样品中食源性致病菌检测的相关研究。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 SERS在食品中食源性致病微生物检测中的应用 Table 1 Typical research about SERS used for detection of foodborne pathogens in food 样品 目标微生物 纳米基底 LOD/判别正确率 参考文献 绿豆芽 沙门氏菌 大肠杆菌 葡萄球菌 Ag NRs功能化 102 CFU· mL-1 [46] 芬达汽水 大肠杆菌 木糖葡萄球菌 Au@Ag vertical NRs — [48] 苹果汁 大肠杆菌 Fe3O4/Au NPs 102 CFU· mL-1 [52] 水样 副溶血性弧菌 Au@Ag NPs 103 CFU· mL-1 [53] 牛奶 沙门氏菌 Au NPs-DNA/cy5 66 CFU· mL-1 [54] 三文鱼 火腿 鸡蛋 混合香料 婴幼儿配方奶粉 沙门氏菌、 单增李斯特菌 阪崎肠杆菌 Ag NPs 98% [55] 苹果汁 自来水 大肠杆菌 PLLA-Au 102 CFU· mL-1 [56] 鸡汤 污水 苹果汁 大肠杆菌 IO@Au NOVs 5× 105 CFU· mL-1 [57]

表1 SERS在食品中食源性致病微生物检测中的应用 Table 1 Typical research about SERS used for detection of foodborne pathogens in food

关于食源性致病微生物SERS检测的研究主要聚焦于不同SERS基底, 不同细菌捕获机制, 不同细菌定性识别等方面。 基底功能化、 标记或无标记分析成为食源性致病SERS检测的主要趋势。 因多种因素的差异导致不同研究灵敏度和检测时间等存在差异, 研究结果依然表明了SERS技术在食源性微生物检测方面的应用潜力。 尽管大多数研究并没有对食品样品中食源性微生物进行了检测分析, 需要在后续研究中进一步深入研究SERS快速检测实际食品样品中的食源性微生物。

SERS在生物医学方面充分展现了无损快速的优势^[58], 成为研究人员关注的热点之一。 常规方法对食源性疾病病理样本, 比如血液、 尿液等样品中致病微生物的分析耗时较长, 不能实现即时诊断, SERS技术的应用可有效解决这一问题, 缩短诊断时间。

大肠杆菌、 葡萄球菌、 变形杆菌等可能导致尿路感染, 采用SERS检测患者尿液中的致病菌可实现病理诊断。 Premasiri等^[59]采用金纳米粒子沉积于硅片上作为增强基底, 手持式拉曼光谱仪对尿液中大肠杆菌、 克雷佰杆菌和腐生葡萄球菌在10⁵ CFU· mL^-1水平进行诊断, 分析在30 min内完成。 Mircescu等^[60]将可能导致尿路感染的大肠杆菌和变形杆菌通过静电张力吸附于带正电荷的玻璃片上形成单细菌层, 分别采用原位制备银纳米粒子或滴加浓缩银纳米粒子用于细菌信号的增强, 可在2 h内对不同致病菌进行诊断。 Avci等^[61]采用银纳米溶胶基底检测了尿液中大肠杆菌、 乳酸球菌、 金黄色葡萄球菌、 腐生葡萄球菌和肺炎肺炎克雷伯杆菌, 并对比分析SERS对细菌不同培养液, 不同培养时间信号响应的差异, 结果表明基于SERS技术经过1 h培养即可实现不同致病菌的诊断判别。 Szymborski等^[56]采用静电纺丝技术在4种不用聚合物纤维上覆盖金层作为SERS基底, 对比分析了不同聚合物覆盖不同厚度金层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌增强效果, 进一步对苹果汁、 自来水和尿液中浓度为10² CFU· mL^-1的大肠杆菌进行了检测。

血液分析在医学诊断中非常普遍, SERS用于血液中致病微生物检测报道中, Sivanesan等^[62]制备了金银双金属增强基底, 对比了万古霉素和头孢他啶修饰基底对大肠杆菌、 肠道沙门氏菌、 表皮葡萄球菌和巨大芽孢杆菌的SERS分析的影响, 并对血液样品中大肠杆菌和表皮葡萄球菌进行分析。 Boardman等^[63]学者为降低血液中血红蛋白等主要组分对SERS分析的影响, 采用微生物浓缩装置将10 mL血样浓缩为200 μ L, 经过短时间培养后吸附于凹形SERS芯片用于检测, 对17个临床血样中浓度范围为10-10⁴ CFU· mL^-1的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌SERS判别正确率为97%, 特异性为97%, 敏感度为88%, 样品前处理方法快速、 简单, 样品量少, 能实现微生物的快速诊断。

生物医学诊断中除了食源性微生物的诊断, 其他致病微生物的诊断也有相关报道^[64], 对不同生物样品, 不同微生物, 制备不同纳米增强基底, 结合免疫技术、 生物传感等手段, 通过SERS实现了快速诊断, 说明了SERS技术在该领域的巨大应用潜力。

随着微流控技术的发展, 微流控平台结合SERS技术被称为“ 芯片实验室” 应用于环境和食品监控、 药物、 生物分子、 细胞、 细菌检测等领域, 已成为近年来研究热点之一^[65]。 在食源性致病微生物检测中, Walter等^[66]基于玻璃微流控芯片结合SERS获得了9种不同菌株大肠杆菌的谱图, 对不同菌株的判别正确率为92.6%。 Mungroo等^[67]设计了2入口和1个出口的微流控芯片结合SERS鉴别了大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 肠炎沙门氏用菌、 绿脓杆菌、 单增李斯特菌、 无害李斯特菌、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌35和86。 为了接近实际检测需要, 对多种微生物检测进行了研究, 但对不同细菌间的判别正确率为64.5%, 对革兰氏阳性菌和阴性菌的判别正确率为72.6%。 Wang等^[68]通过纳米介电泳(nano-dielectrophoretic, Nano-DEP)微流控装置的分离浓缩, SERS可在单分子水平检测大肠杆菌, 对两种不同菌株大肠杆菌的判别正确率高于95%。 采用类似的DEP微流控芯片, Cheng等^{[69, 70]}对血液中金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌进行了鉴别, 可在3 min识别浓度为10⁶ CFU· mL^-1的不同细菌。 Madiyar等^[57]对大肠杆菌的最低检测浓度为210 CFU· mL^-1, DEP经修饰后可在50 s内捕获目标分析物, 并进一步对鸡汤、 污水及苹果汁中大肠杆菌进行了测定, 验证了方法的可行性。 Lin等^[71]对沙门氏菌和乳糖奈瑟球菌进行了检测, 相比ELLSA方法, 检测灵敏度显著提高, 最低检出浓度为70 CFU· mL^-1(ELLSA: 2× 10⁷ CFU· mL^-1), 抗体用量减少了100倍, 诊断时间不超过2 h。 Catalan等^[72]设计了单通道PDMS微流控光学装置, 用于体液中金黄色葡萄球菌的检测, 并对比了抗体和适配体修饰银纳米粒子作为SERS增强基底捕获细菌的差异, 基于该检测方法可对尿液、 血液、 胸膜积液及腹水中浓度低于15 CFU· mL^-1的金黄色葡萄球菌实现大通量监控。 Lu等^[73]也报道了采用PDMS搭建光流控平台结合SERS对两种不同的金黄色葡萄球菌进行了鉴别, 对来自临床分离的58个样品正确判别率超过了95%, 可快速、 高选择性、 高灵敏检测细菌。 不同材料、 结构和作用原理的微流控系统与SERS结合用于食源性微生物检测, 减少了样品用量, 提高了分析的可控性, 稳定性, 特异性和灵敏度, 在微生物分析方面具有极大应用潜力^{[74, 75]}。