用激光脉冲照射植物, 激发其产生荧光。 探测器实际接收到的植物荧光信号为激光脉冲信号、 被测荧光衰减函数与探测器时间响应函数的卷积^{[17, 18, 19, 20]}, 如式(1)所示

m(t)=p(t)⊗g(t)⊗irf(t)(1)

其中: p(t)为激光脉冲信号, g(t)表示植物荧光衰减函数, irf(t)表示光电探测器的时间响应函数, m(t)则为光电探测器获取到的植物荧光信号。 蒸馏水或石英玻璃等不产生荧光的物质的荧光衰减函数g(t)值恒为1^[21], 当用这些物质作测试材料时, 光电探测器接收到的反射激光脉冲信号表示探测系统响应函数

m0(t)=srf(t)=p(t)⊗irf(t)(2)

如将探测系统响应函数srf(t)代入式(1)可得

m(t)=srf(t)⊗g(t)(3)

因此, 只要在测量荧光信号前获取srf(t), 再用m(t)对其解卷积就能得到g(t)。 根据式(4)即可反演植物的荧光寿命。

g(t)=Aexp(-t/τ)(4)

这里A为初始荧光强度, τ 表示荧光寿命。

解卷积算法是反演荧光寿命的关键技术。 向前迭代卷积法是目前反演叶绿素荧光寿命效果相对较好的一种算法^{[22, 23]}, 但依然存在误差。 为提高精度, 可根据植物荧光的特性, 对反演荧光寿命过程中的误差进行精确校正。

1.2.1 向前迭代卷积法的改进

首先将式(3)转化成离散形式, 再根据离散卷积定理就能推导出荧光衰减函数的反演公式

g(n)=[m(n)-∑i=1nsrf(i)g(n-i)]/srf(0)(5)

根据式(5)可求得荧光衰减函数g(n)。

在反演叶绿素荧光寿命过程中, 由于系统响应函数的初始值srf(0)极小, 依照式(5)每次计算g(n)值时, 都要除以srf(0)。 除以一个极小数就相当于乘以一个极大数, 所以每次除法运算的截断误差将被不断放大, 这样荧光衰减函数g(n)的累计误差会越来越大, 所以运用该法反演得到的荧光寿命误差会很大。 每次计算所得g(n)的误差可表示为

σ0=δ0σ1=σ0/srf(0)+δ1σ2=(σ0+σ1)/srf(0)+δ2 …(6)

其中, δ _n(n=0, 1, 2, …, N)表示式(5)中m(n)除以srf(0)产生的截断误差, 这里N为正整数。 依次类推可将式(6)转化为式(7)形式

σn=∑i=0n-1[σi/srf(0)]+δn(7)

当g(n)小于g(n)的真实值时, σ _n< 0; 而g(n)大于g(n)的真实值时, σ _n> 0。

尽管每次除法运算的截断误差δ _n极小, 但每次计算g(n)时, 前一次的截断误差都会累积到本次运算中, 且都要再除以极小值srf(0)。 那么每次计算g(n)时上次累计的截断误差将被放大很多倍。 另外, 系统响应函数srf(t)实际记录的是激光脉冲信号, 而m(t)记录的是激光诱导荧光信号。 激光脉冲信号的初始值srf(0)是极其微弱的激光信号, 无法激发物质产生荧光。 而实际激光诱导荧光信号的初始值m(0)并不是激光脉冲的初始信号激发的, 而是激光脉冲初始信号后边较强的激光信号激发出的。 因此, 理论上系统响应函数初始值srf(0)趋于0; 而激光诱导荧光信号函数的初始值m(0)应该是一个略大于0的值。 实际中很难从探测仪器记录的数据中筛选出真实的srf(0)和m(0)。 通常的办法是在被测信号初始值附近选择最接近0的正值作为信号初始值, 实际中m(0)≈ srf(0)。 由于荧光衰减函数的初始值g(0)=m(0)/srf(0), 而srf(0)的实际值总大于0, 所以实际反演的g(0)就也会偏小, 从而σ ₀< 0。 那么随σ _n不断被放大g(n)值相对其真实值的负偏移量将越来越大。 因此, 被实际反演得到的荧光寿命值将严重偏小。

为解决向前迭代卷积法反演的叶绿素荧光寿命存在误差这一难题, 提出了荧光衰减因子ε (0< ε < 1) 这一概念。 假定m(t)的数据长度为M, srf(t)的数据长度为N, 则g(t)的长度L应为M-N+1。 实际叶绿素荧光寿命反演过程中, 提取g(t)的前(M-N+1)ε 个数据, 设为g_E(t)。 再利用三次Hermite插值方法沿横坐标方向对g_E(t)放大1/ε 倍, 可得到g_E(t/ε )。 再由g_E(t/ε )反演被测叶绿素的荧光寿命。 荧光衰减因子ε 被定义为

ε=1α(tm-tsrf)(8)

式中: t_srf与t_m分别表示srf(t)与m(t)有效数据的长度。 t_srf被定义为从srf_max下降到srf_max/10的数据长度, 这里srf_max表示srf(t)的最大值; t_m被定义为从m_max/e到m_max上升时间的数据长度与m_max到m_max/e下降时间的数据长度之和, 这里m_max为m(t)的最大值, e取2.72。 这里定义的有效数据长度是经验值, 并不精确, 所以须引入修正系数α (0< α < 1)对有效数据长度进行修正, α 值的确定是荧光寿命修正技术的关键。 由g_E(t/ε )可知, 荧光寿命与荧光衰减因子ε 成反比; 再由式(8)可知, 荧光寿命与有效衰减时间的修正系数α 成正比。

1.2.2 荧光衰减因子的确定

荧光衰减因子ε 的确定是荧光寿命校正技术中的关键步骤。 通过仿真得到某一荧光寿命值为τ 的激光诱导荧光信号模型, 用改进后的向前迭代解卷积法处理这个仿真信号, 反演结果为τ _e。 再通过对比τ _e与τ , 对α 不断调整, 最终可获得一个与τ 值很接近的τ _e。 此时对应的荧光修正系数α 为最优化的荧光修正系数。 详细步骤如下所示:

(1)构建荧光寿命为τ 的理想荧光衰减函数模型h(t)为

h(t)=Aexp(-t/τ)(9)

将理想荧光衰减函数h(t)代入式(3), 即用h(t)替换式(3)中的g(t), 可构建相应的仿真激光诱导荧光信号模型m(t)

m(t)=srf(t)⊗h(t)=srf(t)⊗Aexp(-t/τ)(10)

再用改进型向前迭代解卷积法(α 的初始值可在区间[0.1, 0.9]中取任意值), 使m(t)对srf(t)作解卷积处理。 即可得到荧光寿命为τ _e的荧光衰减函数, 这里τ _e为荧光寿命估计值。

(2)对比荧光寿命估计值τ _e与荧光寿命理想值τ , 对荧光修正系数α 进行调整。 由于荧光寿命与修正系数α 成正比。 若τ _e偏小, 应将修正系数α 调大; 若τ _e偏大, 则应将修正系数α 调小; 若τ =τ _e, 说明此时的修正系数α 恰好为被测荧光寿命值τ 对应的最优化修正系数。 经大量仿真, 获得了范围4~12 ns、 间隔时间为0.25 ns的荧光寿命与其对应的最优化修正系数α , 如图1所示, 并拟合τ ~α 的关系曲线。 这样就可通过该曲线获取任意荧光寿命相对应的最优化修正系数α 。

图1

Fig.1

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	图1 荧光寿命与其最优化修正系数的对应关系(4~12 ns)Fig.1 Relationship between fluorescence lifetime and its optimal correction coefficient (4~12 ns)

(3)将最优化修正系数α 代入式(8), 就可得到最优化的荧光衰减因子。 在运用改进后的向前迭代解卷积法处理激光诱导叶绿素荧光信号时, 选取的α 值越接近被测荧光寿命所对应的最优化修正系数, 反演结果的精度就越高。

1.2.3 荧光寿命的校正

尽管可通过τ ~α 的关系曲线获取任意荧光寿命对应的最优化修正系数, 但不可能提前预测被测荧光寿命来获取其最优化修正系数α 。 早期研究中, 凭经验估计α 值, 具有一定实用价值, 但要实现荧光寿命的高精度测量这种方法显然不可靠^{[24, 25, 26]}。 因此, 提出了一种荧光寿命校正方法, 其程序流程图如图2所示。

图2

Fig.2

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	图2 荧光寿命校正程序流程图Fig.2 The flowchart of the fluorescence lifetime correction process

首先, 选取任意荧光寿命τ ₀与其对应的最优化修正系数α ₀作参考点。 第二步, 选取大量不同的荧光寿命值τ _x, 并利用式(10)构建它们对应的仿真激光诱导荧光信号m_x(t)。 再用改进型后的前迭代解卷积法(α =α ₀)使m_x(t)对srf(t)作解卷积处理, 从而可得到一系列的荧光寿命估计值τ _ex, 这一步如程序流程图第三步所示。 由于荧光修正系数α ₀不能表示任意荧光寿命值对应的最优化修正系数, 所以反演得到的各仿真激光诱导荧光信号的荧光寿命τ _ex仅为估计值。 这样通过大量仿真计算就可绘制τ _ex~τ _x平面。 图3表示以τ ₀=8 ns与α ₀=0.475 6为参考点时绘制的τ _ex~τ _x平面。 图中拟合的直线被称为荧光寿命校正曲线, 表示荧光寿命估计值与校正值的对应关系。 其线性方程为

τx=1.2476τex-2.0066 (4< τex< 12)(11)

其线性相关系数为0.99。

在实际荧光信号处理过程中, 通过改进后的迭代解卷积法(α =α ₀)对实际的激光诱导叶绿素荧光信号处理, 获得叶绿素荧光寿命的估计值τ _e, 再将τ _e代入式(11)的变量τ _ex, 最终可得到精准的荧光寿命值τ _x。 这一过程如图2程序流程最后三步所示。 存在一种特殊情况, 当被测荧光寿命恰好等于τ ₀=8 ns(其最优化校正系数α ₀=0.475 6)时, τ _ex=τ _x=8如图3所示。

图3

Fig.3

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	图3 荧光寿命校正曲线(4~12 ns)Fig.3 The fluorescence lifetime correction curve (4~12 ns)

为证实改进后的迭代解卷积算法的正确性, 用Matlab (7.4.0)计算软件对5组不同荧光寿命的仿真激光诱导荧光信号进行处理。 通过式(12)构建荧光寿命τ _i(i=1, 2, 3, 4, 5)分别为4.35, 6.23, 8.63, 10.35和11.62 ns的理想荧光衰减函数。

hi(t)=Aexp(-t/τi)(12)

设初始荧光强度值A为1。 再根据这5个理想荧光衰减函数, 分别绘制对应的衰减曲线, 如图5所示。

图5

Fig.5

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	图5 仿真的理想荧光衰减曲线Fig.5 Ideal fluorescence decay curves by simulation

根据式(10), 将这5个理想荧光衰减函数h_i(t)分别与系统响应函数srf(t)作卷积运算, 就能构建相应的仿真激光诱导荧光信号m_i(t)。 这5个仿真激光诱导荧光信号与系统响应函数的波形如图6所示。

图6

Fig.6

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	图6 仿真激光诱导荧光信号与系统响应的信号波形Fig.6 Signal wave form of laser-induced fluorescence by simulation and the systemic response

图7

Fig.7

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	图7 利用荧光寿命校正曲线校正荧光寿命估计值Fig.7 Correction of the estimated fluorescence lifetime by correction curve

如图1所示, 当τ ₀=8 ns时, 修正系数α 的真实值与拟合值的偏差最大, 分别为0.479 6与0.475 6。 选择这个位置(τ ₀=8 ns, α ₀=0.475 6)作参考点修正荧光寿命估计值τ _ex, 若误差可满足测量需要, 那么以τ ~α 曲线上的任意点作参考点修正荧光寿命估计值, 都可满足测量要求。 以τ ₀=8 ns与α ₀=0.475 6为参考点, 做τ _ex~τ _x平面并绘制荧光寿命校正曲线, 如图7所示。

采用改进型向前迭代解卷积法(α ₀=0.475 6)使5个仿真激光诱导荧光信号m_i(t)分别对系统响应函数srf(t)做解卷积处理, 即可得到m_i(t)相对应的荧光衰减函数g_ei(t), 根据g_ei(t)绘制它们对应的衰减曲线, 如图8所示。

图8

Fig.8

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	图8 反演得到的仿真荧光衰减信号的波形Fig.8 Simulated fluorescence decay signal wave form from retrieved algorithm

由式(4)分别计算这5个荧光衰减函数的荧光寿命估计值τ _ei。 图7为以τ ₀=8 ns与α ₀=0.475 6为参考点时绘制的τ _ex~τ _x平面。 将荧光寿命估计值τ _ei分别代入图7中所示的校正曲线方程中的自变量τ _ex, 即可得到相应的荧光寿命校正值τ _x, 分别为4.36, 6.35, 8.73, 10.35与11.60 ns, 它们分别与初设的理想荧光寿命很接近, 平均相对误差小于1%。

根据上述方法, 进行了大量仿真运算, 对改进后的前迭代解卷积算法的误差进行了详细分析, 分析结果如表1所示。 表1中的仿真次数指在相应荧光寿命范围内随机选取的仿真样本个数, 且各随机样本的荧光寿命皆不相同。 实际中, 若在τ ~α 关系曲线上选取与实际修正系数α 偏差较小的点作为参考点, 那么测量误差会更小。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 荧光寿命测量方法仿真计算的误差分析(4~12 ns) Table 1 Error analysis for the simulation of fluorescence lifetime measurement method (4~12 ns) Lifetime range /ns Maximal relative error/% Minimal relative error/% Average relative error/% Number of simulations 4~5 3.16 0.43 1.36 30 5~6 2.88 0.75 1.05 30 6~7 2.29 0.30 0.69 30 7~8 1.99 0.29 0.81 30 8~9 1.30 0.26 0.56 30 9~10 0.72 0.05 0.39 30 10~11 0.89 0.08 0.51 30 11~12 0.86 0.29 0.43 30 4~12 3.16 0.05 0.73 240

表1 荧光寿命测量方法仿真计算的误差分析(4~12 ns) Table 1 Error analysis for the simulation of fluorescence lifetime measurement method (4~12 ns)

选取生长状态良好的法国梧桐、 银杏、 墨叶碧玉、 金钱草及冬青叶片, 分别裁剪出10 cm², 再将这些叶片组剪成2 mm宽的条状, 将这些叶片放入80 mL用80%的丙酮与95%的乙醇以体积比2:1配制成的混合溶液里。 约24 h后植物组织变白时, 就可得到这几种植物的混合叶绿素提取液。 用紫光LED灯照射提取液, 激发其产生叶绿素荧光, 再用光谱仪获取其光谱, 如图9所示。 叶绿素提取液在约680 nm波长处的荧光最强, 因此在设计激光诱导植物荧光寿命测量系统时, 选择使用中心波长680 nm的滤光片。

图9

Fig.9

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	图9 叶绿素溶液的荧光光谱图Fig.9 The fluorescence spectra from chlorophyll solution

分别配制2.73, 3.36, 5.12, 6.31和8.65 mg· L^-1的叶绿素溶液进行测试。 在用图4所示的示波器采集的数据取30次平均值。 用示波器采集各溶液的荧光信号m(t)及系统响应函数srf(t)的波形如图10所示。 对采集到的信号去噪后, 再用m(t)对srf(t)解卷积就能得到叶绿素的荧光衰减曲线, 如图11所示。

图10

Fig.10

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	图10 不同浓度叶绿素溶液的荧光信号波形(30次平均值)Fig.10 Measured fluorescence signal curves in different concentrations of chlorophyll solution

图11

Fig.11

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	图11 不同浓度叶绿素溶液的荧光衰减曲线Fig.11 The fluorescence decay curve of chlorophyll solution

根据式(4)计算出各荧光衰减函数对应的荧光寿命τ _ej, 分别为5.70, 5.88, 6.51, 6.79与6.88 ns。 由于在使用改进后的前迭代解卷积算法进行荧光寿命反演时, 选定的荧光修正系数α ₀=0.475 6并不是任意被测荧光寿命对应的最优化修正系数, 所以τ _ej仅为估计值, 还须对其进行校正。 以τ ₀=8 ns, α ₀=0.475 6为基准, 作τ _ex~τ _x平面图, 并且拟合荧光寿命校准曲线如图12所示。

图12

Fig.12

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图12 运用校正曲线校正荧光寿命估计值Fig.12 The estimated fluorescence lifetime is corrected from calibration curve

这里的5种不同浓度溶液的荧光寿命估计值τ _ej与其校正值的关系如图12中校正曲线上的5个圆点所示, 圆点的横坐标分别表示这5种浓度溶液荧光寿命的估计值τ _ej。 将这5个估计值τ _ej分别代入图12中荧光寿命校正曲线方程式的变量τ _ex, 即可计算出它们相应的荧光寿命的校正值τ _x。 这5种浓度叶绿素溶液的荧光寿命测量结果如表2所示。 经大量实验证明: 叶绿素溶液的浓度与其荧光寿命值成正比例关系, 由此可见, 植物叶绿素含量与其荧光寿命具有相关性。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同浓度叶绿素溶液荧光寿命的测量结果 Table 2 Measured results of chlorophyll solution fluorescence lifetime in different concentrations Chlorophyll concentration /(mg· L-1) The estimated fluorescence lifetime τ ei/ns The corrected fluorescence lifetime τ i/ns 2.73 5.70 5.10± 0.05 3.36 5.88 5.33± 0.06 5.12 6.51 6.11± 0.04 6.31 6.79 6.45± 0.04 8.65 6.88 6.58± 0.05

表2 不同浓度叶绿素溶液荧光寿命的测量结果 Table 2 Measured results of chlorophyll solution fluorescence lifetime in different concentrations

为获取叶绿素含量的标定曲线, 配制一组叶绿素浓度分别相差~0.25 mg· L^-1的溶液。 用如图4所示的激光诱导叶绿素荧光寿命测量系统分别获取各溶液的激光诱导叶绿素荧光信号, 再分别运用改进后的向前迭代解卷积法反演各溶液的叶绿素荧光寿命, 就可拟合出表示叶绿素荧光寿命与叶绿素含量关系的标定曲线, 其线性相关系数r=0.965 4, 如图13所示。 如果运用这种方法进行大量类似工作, 就能得到高精度的叶绿素含量标定曲线, 从而实现高精度的叶绿素含量分析。 即通过测量未知溶液的叶绿素荧光寿命, 再由标定曲线展示的叶绿素含量与荧光寿命之间的关系来评估被测溶液的叶绿素含量。

图13

Fig.13

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	图13 不同浓度叶绿素溶液的荧光寿命标定曲线(用改进后的迭代向前迭代解卷积法反演的荧光寿命)Fig.13 Calibration curve of chlorophyll fluorescence lifetime in different chlorophyll concentrations (The values are retrieved by improved method of forward iterative deconvolution)