采用头孢他啶作为本研究所用的抗生素, 这是一种常用的第三代头孢菌素类抗生素, 作用于细菌细胞壁的合成过程^[17]。 活性污泥取自实验室反应器, 将污泥悬浮液稀释100倍后接种至含有抗生素的液体LB培养基(蛋白胨10 g· L^-1, 酵母粉5 g· L^-1, NaCl 5 g· L^-1)中, 添加头孢他啶的浓度为100 mg· L^-1。 接种好的菌液在摇床中培养2 d, 培养转速为120 r· min^-1, 温度为30 ℃。

从培养基中取菌液梯度稀释至10^-6倍, 取200 μ L的稀释菌液均匀涂布于含有头孢他啶的固体LB培养基(液体LB培养基中按每100 mL加2 g琼脂粉配制而成), 头孢他啶的浓度也为100 mg· L^-1。 在30 ℃下恒温培养24 h。 用接种环挑选形貌不同的菌落在新的培养基上进行划线分离, 并培养24 h。 重复划线培养2代, 以得到菌落单一的纯菌。 每次划线的培养基菌涂布100 mg· L^-1的头孢他啶, 以达到持续筛选的目的。 所有的操作均在无菌超净台上进行。

(1)细菌培养。 配制固体无机盐培养基: Na₂HPO₄· 12H₂O 3.8 g, KH₂PO₄ 1 g, KCl 3 g, MgSO₄· 7H₂O 0.2 g, NH₄NO₃ 1.15 g, Fe₂(SO₄)₃· H₂O 0.01 g, NaMoO₄· 2H₂O 0.01 g, MnSO₄· H₂O 0.01 g, 琼脂粉(每100 mL添加2 g), 在无机盐培养基表面均匀涂布100 mg· L^-1的头孢他啶溶液。 将前述分离得到的纯菌接种至含有抗生素的无机盐培养基中, 进一步筛选出能在只含头孢他啶的无机培养基上生长的菌株。

将进一步筛选出的各细菌经过扩培后分别接种200 μ L至液体无机培养基中, 配方同前, 加入抗生素的初始浓度为250 mg· L^-1, 置于摇床上, 以120 r· min^-1摇动, 30 ℃培养48 h。 隔12 h取1.5 mL菌液于离心管中待用液相色谱分析头孢他啶含量。

(2)头孢他啶含量测定。 用液相色谱分析抗生素的残留量, 采用Agilent 1260 Infinity液相色谱仪, 流动相为磷酸缓冲溶液(磷酸氢二钠3.6 g, 磷酸二氢钾1.4 g, 加水溶解并稀释至1 000 mL)与甲醇(色谱纯)以4:1配制而成, 流速为1.0 mL· min^-1; 检测波长254 nm。

采用Solarbio公司(北京)的头孢他啶(纯度98%)制备浓度分别为100, 200, 400, 500, 600, 800和1 000 mg· L^-1的头孢他啶标准溶液, 测得各标准溶液的出峰面积, 拟合得到标准曲线。

将各时间点取的菌液在5 000 g离心力下离心10 min, 取上清液经0.22 μ m滤膜进行过滤。 操作均在无菌超净台上进行。 取过滤后的溶液0.5 mL至进样瓶中, 再用液相色谱进行分析, 通过峰面积插入标准曲线得到头孢他啶浓度。

利用16S rRNA鉴定法对筛选出的菌株进行鉴定。 操作流程主要包括细菌DNA基因组提取, 利用特异引物扩增16S rRNA序列, 并纯化扩增产物, 然后对产物进行DNA测序获得16S rRNA序列, 将获得的序列与数据库已知细菌的DNA序列比对, 即可得到菌株的属别。 上述实验均由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

拉曼光谱仪采用的是Reinshaw公司生产inVia Reflex显微拉曼光谱仪。 使用532 nm半导体激光源, 光谱分辨率1 cm^-1, 采用100× 物镜, 单点曝光时间为10 s, 激光功率为50 mW, 采集次数为1次, 扫描波数范围为700~1 800 cm^-1。

(1)分别采用普通载玻片, 石英玻璃片, 氟化钙作为基底, 相同条件下测试样品的拉曼光谱。

(2)单个细菌样品和多菌体样品的拉曼光谱。 将筛选的细菌在液体LB培养基中培养24 h。 取1 mL菌液至1.5 mL离心管, 在5 000 g离心力下离心5 min。 去除上清液, 加入蒸馏水, 使细菌重新悬浮, 并振荡菌液洗去细菌表面培养基及其他杂质, 蒸馏水重复洗3次, 得到细菌的水溶液, 吸取50 μ L于石英片上, 尽量使液滴平铺, 使细菌分散, 将载玻片进行干燥(含水时会造成细菌的运动), 即得到单个细菌样品, 在拉曼光谱测试时, 选取分离较好的单个细菌进行测试。 多菌体样品即为多个同种细菌, 制备需经过同样的操作进行细菌的清洗, 重复清洗后, 在5 000 g离心力下离心5 min, 去除上清液得到分离的菌体, 吸取滴加至基底后, 直接将样品置于载物台上进行拉曼测试。

(3)不同菌种的拉曼光谱测定。 制作各菌种的多菌体样品, 采用石英片基底, 在相同的参数条件下测得拉曼光谱。 各菌株分别随机取3个点进行测定, 每个点重复测定3次。 对得到的光谱先进行平均光谱计算, 然后对光谱进行平滑降噪, 再对光谱的基线进行样条曲线拟合, 去除基线, 读取峰位及峰高。

(4)PCA主成分分析(principal component analysis)。 使用SPSS统计分析软件(IBM)对光谱数据进行PCA分析。 选取测得光谱中峰形较好, 且峰位稳定的峰, 读取峰高, 作为PCA分析的变量; 计算各变量相关系数, 继而对变量进行降维处理, 计算出主成分, 得出各变量在主成分上的荷载; 最终得到各光谱数据的主成分得分图。

通过划线分离, 并通过含有头孢他啶的固体LB培养基筛选, 共得到14株纯菌株, 分别编号为C1— C14。 对这14株菌株进一步利用只含头孢他啶的固体无机盐培养基进行筛选, 有7株细菌长出了菌落, 分别为C1, C2, C5, C8, C10, C12。 将这7株菌株分别接种至抗生素浓度为250 mg· L^-1的液体无机盐培养基中, 利用液相色谱分析出抗生素浓度随时间变化如图1所示。

图1

Fig.1

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	图1 各菌株对抗生素的降解效果Fig.1 Antibiotic degradation effect of different strains

根据抗生素浓度变化曲线, 空白对照组中的抗生素浓度下降, 说明头孢他啶本身在培养条件下会出现一定降解, 这与顾佳萍等^[18]的报道一致。 菌株C5的培养液中在36 h时出现了上升, 显然是实验误差, 根据整个折线的趋势, 菌株C5, C8与空白对照组中抗生素浓度接近, 说明其对抗生素不具有降解作用, 而C1, C2, C10, C12对抗生素具有明显的降解作用, 扣除抗生素的自发降解, 四种菌株对抗生素的降解率分别为18.24%, 41.99%, 28.96%, 45.44%。

对C1, C2, C10, C12进行16S rRNA测序鉴定菌种, 鉴定结果C1, C2同为气单胞菌属(Aeromonas sp.), 革兰氏阴性菌; C10为芽孢杆菌属(Bacillus sp.), 革兰氏阳性菌; C12为红球菌属(Rhodococcus sp.), 革兰氏阳性菌。

对普通玻璃、 石英、 氟化钙三种基底进行了比较, 在532 nm的激发光下, 进行测试, 分别得到相应的光谱, 如图2所示。 普通载玻片在900~1 200 cm^-1处有很强的峰, 而蛋白质的峰位主要在这个区间^[19], 峰高达到了5 000, 会严重影响蛋白质光谱信息的获取; 石英在750~850 cm^-1处有明显的峰, 1 000~1 200 cm^-1处有较小的峰, 前者的峰高达到了4 000, 一些核酸物质的特征峰在这个区间段, 但是对于900 cm^-1以后的物质信息获取影响较小; CaF₂在700~1 750 cm^-1之间都有着良好的基线水准, 有一些小的峰峰高都在500以内。

图2

Fig.2

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	图2 三种基底的拉曼光谱Fig.2 Raman spectroscopy of three kinds of substrates

用三种基底分别测定C1(气单胞菌属细菌属)的拉曼光谱, 普通玻璃载玻片背景非常强, 细菌本身的光谱信息基本被掩盖; 石英片在小于900 cm^-1的波段信号受影响很大, 大于900 cm^-1后的信号也受到了一定影响, 但能够显示出一些细菌本身的信息; CaF₂作为基底测出的光谱背景较小, 显示出的细菌光谱信息丰富, 如图3所示。 相比而言, 普通玻璃的背景过强, 特别对于生物样品, 其拉曼信号比较弱, 背景干扰将更大, 信息损失很严重如图3(a)所示; 石英片也有一些背景峰, 但是比较靠前, 生物体的拉曼信号主要集中在600~1 800 cm^-1之间, 因此信息的损失并不太严重, 如图3(b)所示; CaF₂是三者中在600~1 800 cm^-1范围内背景最小的, 基本是比较平直的一条线, 细菌本身的信号基本都能得以显现, 如图3(c)所示。 主要原因可能由于CaF₂是一种难溶于水的离子晶体, 其离子键很强, 拉曼活性弱。 同时CaF₂非常稳定, 不会对生物样品造成影响。 因此, 生物样品的拉曼测试, CaF₂是一种比较理想的基底。

图3

Fig.3

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	图3 (a)玻璃载玻片(b)石英片(c)CaF2作为基底时C1的拉曼光谱(上)及背景(下)Fig.3 Raman spectroscopy of C1 (up) and the background (down) when (a) Glass (b) Quartz (c)CaF2 to be substrate

多菌体样品和单个细菌测出的拉曼光谱区别也有显著差异。 如图4所示, 多细菌样品的拉曼光谱与单个细菌的拉曼光谱相近, 但比单个细菌的拉曼光谱展现了更多的信息, 更多峰强比较小的峰显现了出来, 同时也具有更高的信噪比。 说明拉曼光谱虽然能测定极少量的物质, 但样品过少时, 背景影响较大; 反之, 样品量较多时可以减少背景对样品光谱的影响, 增加样品量有助于提高拉曼光谱测定的稳定性和准确度, 因此, 多菌体的拉曼光谱更能准确反映细菌内的物质信息。

图4

Fig.4

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	图4 多细菌(上)和单个细菌(下)测得的拉曼光谱Fig.4 Raman spectroscopy of multiple bacterium (up) and single bacteria (down)

对筛选出的抗性菌C1, C2, C10, C12进行拉曼测定, 同时以菌株C8作为对比, 将得到的原始拉曼光谱进行去基底, 平滑等处理后得到了如图5所示的拉曼光谱。 由于是多细菌测得的拉曼光谱, 反映了各菌种拉曼光谱的平均值, 从直观上, 各菌种的拉曼光谱基本波形类似, 都具有明显的几处峰: 748 cm^-1(碱基T), 1 003 cm^-1(苯丙氨酸), 1 126 cm^-1(蛋白质、 葡萄糖C— C振动), 1 172 cm^-1(蛋白质CH₂变形振动), 1 308 cm^-1(酰胺Ⅲ ), 1 338 cm^-1(碱基A、 色氨酸), 1 585 cm^-1(色氨酸)^[20], 说明在细菌的拉曼光谱中, 蛋白质和核酸的拉曼信号是较强的, 为主要信息, 而脂质和糖类信号较少, 或者不如蛋白质和核酸信号强。

图5

Fig.5

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	图5 各菌种的拉曼光谱Fig.5 Raman spectroscopy of different strains

为了更深入地对各种类菌株的拉曼光谱进行深入的差异分析, 对各组数据进行了PCA分析, 每个菌株随机取3个不同的样本点进行测定, 每个点测定3次, 对每个点测得的光谱求出平均光谱, 共得到来自5个菌株的15个光谱数据。 分析过程采集了748, 782, 817, 855, 920, 972, 1 003, 1 127, 1 171, 1 308, 1 448, 1 585, 1 661 cm^-1共13个峰形较好峰, 以备峰高作为变量, 共提取了3个主成分, 3个主成分的累积荷载平方和达到83.9%, 说明这个主成分分析有效地提取了各光谱的主要差异, 能较好的全面反映光谱特征。

如图6(a)所示, 在主成分1和主成分2分析图中, 各菌株的数据能够较好的分开, 除了C1和C10的得分数据点区域有交集, 其他的数据点都比较好的分离, 但图6(b)主成分1和主成分3的得分图中, C10的数据点和其他菌种的数据点很好的分开了, 说明在所采集的峰值数据中, 各菌株拉曼光谱是有明显差异的, PCA分析的效果比较好。 显然, 拉曼光谱显示出了很强的分辨能力, 通过物质的差异表征了不同菌种的差异。 与传统的生物分析, 菌种鉴别相比, 拉曼光谱测定大大减少了工作量和工作时间, 具有很大的应用优势和潜力, 随着拉曼光谱技术在生物领域更广泛的应用, 其准确性和分辨能力将会得到更大的改善。

图6

Fig.6

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	图6 各菌数据(a)主成分1和2(b)主成分1和3得分图Fig.6 (a) PC1 and PC2 , (b) PC1 and PC3 score plots of different strains

根据PCA分析得到1 308, 748, 920, 1 127, 1 171, 1 003, 972, 1 585, 817, 782 cm^-1在第一主成分上荷载较大, 主要是蛋白质主链C— C键, 碱基中PO₂键的特征光谱, 而第二主成分荷载较大的则是1 661和1 448 cm^-1两个峰值, 是酰胺Ⅰ 和糖类C— H₂振动的特征峰^[15], 855 cm^-1处峰值在第三主分上荷载较大, 其代表的则是酪氨酸对羟基苯环振动。 在本实验条件下, 细菌光谱中蛋白质、 核酸的信息量比较大, 并且具有相似性, 主要成分比较类似, 糖类和脂质所反映的信息较少, 但是蛋白质与核酸的比例会有所不同, 这种差异不太容易直观的分析, 但能够通过统计分析方法表现出来; 各菌种更细致的差异则来源于蛋白质的侧链构象、 氨基酸的种类等, 如峰1 448和855 cm^-1, 这些也包含在拉曼光谱的信息中。 能显示出生物体内更精细的物质结构, 这是拉曼光谱相对于其他测定物质成分方法的优势所在。 某些具有特殊拉曼信号的细菌则可通过特殊拉曼信号区分, 如芽孢杆菌中的吡啶二羧酸钙就是一种拉曼信号极强的物质, 凭此可以区分芽孢态的芽孢杆菌。 总的来说, 拉曼光谱对生物成分的测定不需要根据对象进行方法的选择, 无需针对性的测定, 得到的是所有物质成分的信息, 显然这是极具优势性的特点。