红外热成像与近红外光谱结合快速检测潜育期番茄花叶病
朱文静1,2, 李林1,2, 李美清1,2, 刘继展1,2, 魏新华1,2
1. 江苏大学现代农业装备与技术省部共建教育部/江苏省重点实验室, 江苏 镇江 212013
2. 江苏大学农业装备工程学院, 江苏 镇江 212013

作者简介: 朱文静, 女, 1981年生, 江苏大学现代农业装备与技术省部共建教育部/江苏省重点实验室博士研究生e-mail: zwj0410@foxmail.com

摘要

现有的番茄花叶病无损检测方法无法在潜育期内, 即显症之前进行早期识别导致施药不及时或者盲目过度施药。 设计与试制了红外热成像信息采集系统, 主要包括: 光箱、 红外热成像仪、 温度及升降控制器、 加热板和升降载物台。 该系统能够根据温度起止节点的要求, 人为调节拍摄温度。 在江苏大学现代农业装备与技术省部共建重点实验室Venlo型温室中进行非抗病性番茄品种辽宁农科院L-402的培育。 采用叶面摩擦接种花叶病毒(Tobacccco mosaic virus, ToMV), 分为轻度感染组(LI), 重度感染组(SI); LI组为磷酸缓冲液稀释500倍后的病毒液接种, SI组为病毒原液接种。 对照组(CG)喷施等量磷酸缓冲液。 接种10 d后叶片开始出现病斑, 证明接种后9 d为番茄花叶病的潜育期。 使用红外热成像系统采集了三个组共计144个样本的红外热成像图, 计算叶表最大温差(MTD) 以表征潜育期内连续9 d内的叶面温度变化情况。 CG组叶片的MTD值差异极小, 而接种后叶片MTD值随着病毒侵染时间的推进发生了显著的变化。 接种6 d后MTD值差异最大可达1.63 ℃, 第7 d开始差异逐步缩小, 表明病毒的扩散范围增大导致病叶越来越多的区域被侵染使得整体叶温上升。 光谱采集采用两种方法进行, 一种是根据热像图的MTD值计算判别出温度突变区域后采集光谱, 记为热像采集法(TCM); 另一种是不考虑病灶位置, 在叶尖、 叶中、 叶基三个区域分别随机选择一个点采集光谱后求平均值, 记为随机采集法(RCM)。 TCM确定三个光谱采集点的选择原则是: LI组接种后3, 6和9 d的温度突变区域平均MTD值比CG组温度分别高出0.3, 0.7和0.5 ℃。 SI组接种后3, 6和9 d的温度突变区域平均MTD值比CG组温度分别高出0.5, 1.2, 0.8 ℃。 差值达到此标准的病灶位置才定为TCM的可选区域。 对所有样本采用支持向量机(SVM)算法建立识别模型。 采用主成分分析对2 151个波长点的光谱信息进行压缩, 前6个主成分所对应的累积方差贡献率已到达99%。 分别对感病3, 6和9 d的样本按照2:1的比例划分校正集和预测集, 对预测集样本的病害程度进行识别。 两种方法所建立的模型的总识别率分别为92.59%和99.77%。 采用TCM建立的光谱识别模型中仅有接种后3 d的一个LI组样本未能识别出来, 被误判成CG组样本外, 其余组识别率均达到了100%。 结果表明近红外光谱法识别番茄花叶病是可行的。 采用红外热成像结合近红外光谱法能够建立识别率更高的番茄花叶病潜育期识别模型, 克服点源采样随机性, 对后续管控流程和突破作物早期精准用药的关键技术探索, 建立更为精准的温室智能施药系统提供了新的思路。

关键词: 红外热成像; 近红外光谱; 潜育期; 番茄花叶病; 支持向量机
中图分类号:O433.4 文献标识码:A
Rapid Detection of Tomato Mosaic Disease in Incubation Period by Infrared Thermal Imaging and Near Infrared Spectroscopy
ZHU Wen-jing1,2, LI Lin1,2, LI Mei-qing1,2, LIU Ji-zhan1,2, WEI Xin-hua1,2
1. Key Laboratory of Modern Agricultural Equipment and Technology, Ministry of Education & Jiangsu Province, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;
2. School of Agricultural Equipment Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China
Abstract

The lagging diagnosis method of tomato mosaic disease results in untimely and excessive application of pesticide. The conventional nondestructive testing methods were unable to be applied at early recognition in the incubation period. In this study, the infrared thermal imaging information acquisition system was designed. The efficiency and accuracy of this system were also tested. The main components of the system included a shell box, an infrared thermal image acquirer, a temperature and lift controller, a heating plate and a lift load table. The system developed in this study has the capacity to adjust the shooting temperature manually according to the requirements of the temperature range in a typical experiment. To test the precision of the system, the non-resistant tomatos variety L-402 were cultivated by Institute of Vegetables of Liaoning Academy of Agricultural Sciences in the Venlo type greenhouse of the Ministry & Provinces?Co - construction Key Laboratory of modern agricultural equipment and technology of Jiangsu University. The virus (Tobacccco mosaic virus, ToMV) infection experiment was conducted by using the method of leaf surface friction before the flowering stage. In the virus infection experiment, tomato plants were divided into three groups. The severe infection group (SI) was inoculated with the original virus solution. The Low-grade infection group (LI) was inoculated with diluted virus solution (500 times dilution by phosphate buffer). The control group (CG) was sprayed with equal amount of phosphate buffer. After 10 days of inoculation, spots began to appear on leaves of tomato plants in SI group, suggesting that the first 9 days were the incubation period of tomato mosaic disease. Infrared thermal imaging system was used to collect infrared thermal imaging of those three groups with a total sample size of 144 during the incubation period. The maximum temperature difference (MTD) of the leaf table was calculated to characterize the change of leaf temperature in continuous 9 days during the incubation period. The MTD value of the leaves in the CG group was statistical non-significant, but the MTD value of the leaves in both LI and SI groups was significantly changed after inoculation with the infection time of the virus. After six days of inoculation, the maximum difference of MTD value can reached 1.63 ℃. The difference gradually narrowed down from 7 days, indicating that the virus were spread to more and more regions on the infected leaves and raised the temperature of the whole leaf. Two spectral acquisition methods were conducted. The first one was Thermal-imaging collection method (TCM). During TCM, spectra were intensively acquired during the temperature mutation region which was calculated based on the MTD value from the infrared thermograph. The second method was to acquire spectrum on randomly selected points on the tip, middle, and base of leaves without focusing on the location of the lesion. This spectrum acquisition method was recognized as random collection method (RCM). The principle of TCM to select the effective position for the three spectral acquisition points was that the average MTD value of the mutation zone in the LI group was 0.3, 0.7 and 0.5 ℃ higher than those in the CG group on the 3rd, 6th and 9th day after inoculation respectively.The average MTD value of the mutation zone in the SI group was 0.5, 1.2 and 0.8 ℃ higher than those in the CG group on the 3rd, 6th and 9th day after inoculation, respectively. Lesion position met the above criteria could be considered as an optional area for TCM. All samples were ide.pngied by using Support Vector Machine (SVM) algorithm for discriminant analysis. The principal component analysis (PCA) was used to compress the spectral information of 2 151 wavelength points. The cumulative variance contribution rate of the first six principal components has reached 99%. The samples of 3, 6 and 9 d were divided into the correction set and the prediction set at the ratio of 2:1, and the disease degree of the prediction set samples was ide.pngied. The total recognition rates of the models established by the two methods are 92.59% and 99.77%, respectively. In the spectral recognition model established by TCM, only one sample from LI group after 3 d was unable to be ide.pngied and mistaken into CG group. Despite this sample, the remaining recognition rate reached 100%. The results showed that it is feasible to use near infrared spectroscopy to ide.pngy tomato mosaic disease at early stage. Using infrared thermal imagingin combination with near-infrared spectroscopy technique allows us to establish higher recognition rate models for identification of tomato mosaic disease during incubation period. This study provided an alternative method for the development of follow-up control process, and created a new model to break through the bottleneck of the early precise pesticide spraying of crops. It overcame the point source of NIR sampling randomness and helped to establish a more accurate intelligent pesticide application system in greenhouse.

Key words: Infrared thermal imaging; Near infrared spectroscopy; Incubation period; Tomato mosaic disease; Support vector machine
引 言

目前, 我国已经成为仅次于美国的全球第二大番茄种植国和第一大番茄制品出口国, 仅新疆地区番茄制品的年产能已经突破200万吨。 番茄病毒病是在世界范围内广泛发生的番茄主要病害, 田间症状多样, 番茄花叶病是最常见也是危害最大的病害之一, 直接引发减产、 品质下降、 甚至死亡, 使得农业生产造成重大损失, 严重影响经济效益。 实时、 灵敏、 可靠的检测和防治是番茄科学生产管理的基础。

植物受到病害的侵染过程是指病原物侵入寄主到寄主发病的全过程。 这个过程又分为侵入期、 潜育期[1]、 发病期, 其中潜育期最短的几天, 长的可达一年。 肉眼观察到叶片的病斑时已经是发病期, 如何在潜育期尽早识别, 解决在变量施药过程中定位喷雾和喷洒剂量的问题是精准施药的核心难题。

目前国内外作物营养及病害诊断的常用方法主要有可见/近红外光谱和计算机视觉两大类[2]。 可见/近红外光谱因采用点源采样而具有随机性, 无法解决病原菌早期侵害的病灶敏感区域的快速定位问题。 计算机视觉检测作物病害时, 要全面了解掌握作物叶片受害的相关特征信息, 一般是通过提取RGB图像或者某一波长下的灰度图像, 提取颜色、 形态、 纹理等特征变量进行分析, 这就需要在肉眼能观察到病斑以后进行试验, 利用植物叶片在显症之后面积较大的病斑或枯斑与非显症部分进行分割[3], 在未显症之前根本无法判别。 假设叶片尚处于发病前的潜伏期, 那么基于视觉图像类的技术手段也无法实现早期诊断。 因此迫切需要探索新的检测方法实现作物病害潜育期准确诊断, 将病害消灭在萌芽阶段, 指导施肥和灌溉, 实现“ 早用药、 少用药” , 为作物病害的综合防治提供科学的决策依据。

红外热成像技术以其对温度的高敏感性和在线检测的可行性, 目前在电气、 航空和医学等均有比较成熟的研究成果, 在农业生产的诸多领域也有相关的应用[4, 5]。 利用热成像的特性, 有望在肉眼无法观察到的潜育期实现植物病害的早诊断。 原因是植物体受到病害或者营养胁迫, 往往会调节自身体内的信号网络去适应不断变化的环境刺激。 呼吸、 光合作用、 蒸腾作用、 气孔导度等故而均发生变化, 继而在叶温上发生改变, 即植物收到病菌侵入时与人体类似, 在完全发病前其温度会有相应的变化[6, 7, 8]

本工作开展基于红外热成像与近红外光谱结合的番茄病害潜育期检测方法研究。 近红外光谱检测作物病害的生化信息具有较好的效果, 它能够直接反映分子内部结构及运动状态[9]。 建立红外热成像与近红外光谱的番茄病害潜育期诊断评价模型, 获取病灶位置、 面积大小等重要信息具有直观性。 为作物病害的早期诊断仪器的研发提供理论依据和方法参考。

1 实验部分
1.1 样本培育与制备

在江苏大学现代农业装备与技术省部共建重点实验室Venlo型温室中进行番茄育苗, 选育品种为非抗病性番茄品种。 选用符合国家有关标准的有机活性育苗基质培养。 待番茄苗长至壮苗期, 采用叶面摩擦接种病毒。 病毒由江苏省农科院植保所提供。 接种后移至独立温室避免感染其他作物。 摩擦接种法会破坏叶片表皮细胞, 因此接种叶片选择下部成壮叶, 即从上至下第3或4片羽状复叶。 首先用蒸馏水喷洗叶面去除灰尘和泥沙, 再由移液枪移取15 mL病毒液喷施于叶面进行接种, 最后用极细石英砂从叶基至叶尖方向轻度摩擦三次以保证病毒接种成功和后续系统性侵害的发生。 接种病毒按照由轻到重的顺序进行。 将接种组和健康对照组分别置于不同泡沫箱内在11 ℃条件下黑暗保湿24 h后取出。 接种病毒浓度分梯度进行, 形成轻度感染(low-grade infection, LI)和重度感染(severe infection, SI) 的番茄样本。 LI样本组采用磷酸缓冲液稀释500倍后的病毒液接种, 而SI样本组则采用病毒原液接种, 同时培养对照组(control group, CG)样本, 对照组喷施等量磷酸缓冲液, 并做好详细记录。

1.2 仪器

课题组自行研制的作物红外热成像信息采集箱如图1所示。 主要组成部分包括: 光箱、 红外热成像仪(FIUKE Ti55, USA)、 温度和升降控制器、 加热板, 升降载物台。 该系统能够根据温度起止节点的要求, 人为调节拍摄温度, 实现在某温度阈值内连续拍摄的需求, 升降载物台能够方便的调节拍摄距离。 红外热成像仪的测量精度为≤ 0.05 ℃。

图1 红外热成像信息采集箱Fig.1 Infrared thermal imaging information acquisition system

光谱测量采用美国ASD 公司生产的FieldSpec® 3型便携式光谱分析仪, 测量范围350~ 2 500 nm, 共采集2151个波长点; 在350~1 000 nm 光谱区采样间隔为1.4 nm, 分辨率为3 nm; 在1 000~2 500 nm 光谱区采样间隔为2 nm, 分辨率为10 nm。

1.3 数据采集

每天上午9:00— 12:00时段打开检测系统平衡30~40 min以消除环境温度对测量准确度的影响。 拍摄前关闭内箱箱门, 将热像仪机身与镜头旋转90° 后放置在玻璃架上, 镜头位置与预留的拍摄孔位相契合, 镜头位于植株正上方。 通过升降载物台控制镜头与叶片距离为(30± 5) cm。

接种10 d后所有接种植株开始出现病斑, 说明番茄花叶病接种成功, 整个潜育期为9 d。 潜育期内每天上午9:00— 12:00采集红外热像图, 第3 d, 6 d和9 d, 采集完红外热成像图后立即对该叶片进行近红外光谱数据的采集。 在接种植株中共选取144片番茄叶片作为样本, LI, SI和CG组各48片。 两种方式测定, 一种方式如图2(a)所示, 采集叶尖、 叶中、 叶基三个区域, 每个区域采集一个点的光谱求平均值, 记为随机采集法(random collection method, RCM); 另一种方式如图2(b)所示, 对红外热像图显示的温度突变区域进行三次光谱采集后求平均值, 记为热像采集法(thermal-imaging collectionmethod, TCM)。 图中黑点为光谱探测器的光纤探头探测位置。

图2 GCM(a)和TCM(b)光谱取点位置比较Fig.2 Position comparison of spectral acquisition points in GCM (a) and TCM (b)

图3 接种6天后叶片原始光谱(a)和SNV预处理光谱(b)
番茄花叶病接种6 d后样本的光谱图以及光谱预处理后的光谱图如图3(a)所示, 光谱预处理方法为标准正态变量变换(standard normal variate transformation, SNV), 变换后光谱如图3(b)所示。
Fig.3 Primordial (a) and SNV preconditioned (b) spectra of leaf inoculated for 6 days

1.4 数据处理软件

采用SmartViewTM软件进行红外热成像图分析。 建模数据处理基于Matlab Version 2010a (Mathworks Inc., Natick, Mass., USA)软件平台。

2 结果与讨论
2.1 健康与染病叶片红外热成像图分析

图4(a), (b)和(c)分别显示了CG, LI和SI组番茄植株叶片在接种3 d后拍摄的红外热像图。 在图4(a)的健康番茄叶片呈现较均匀的低温蓝色, 没有发生温度突变现象。 图4(b)所示的轻度感病叶片表现为黄色, 此时虽然感病程度尚浅, 仅为接种第3 d, 但是从温度图中已经明显可以和对照组区别开来。 图4(c)所示的重度感病叶片的温度用右侧温度棒标出, 叶片中部右侧橙红色高温区域代表24.8 ℃左右, 其余黄色代表24.3 ℃左右, 接种3 d便已经表现出一定的温度差。 可见当叶片摩擦接种病毒后, 病毒经微伤口进入活细胞繁殖, 通过胞间连丝迅速移动到邻近细胞, 再经由维管束、 筛管, 迅速移动到新的生长点, 对叶片进行侵染。 通过图4的分析可以表明肉眼观察红外热像图能够更早的捕捉到发病信息。

图4 接种3天后的红外热成像图
(a): CG; (b): LI; (c): SI
Fig.4 Infrared thermal images of leaves after 3 days inoculation
(a): CG; (b): LI; (c): SI

2.2 病毒侵染过程分析与TCM定位

重度感病叶片在显症前的红外热像图如图5所示。 图5(a)为未接种病毒前的红外热成像图, 叶片呈现均匀的淡蓝色, 经过SmartViewTM软件自动识别计算淡蓝色区域的平均温度为23.2 ℃。 图5(b)为接种后3 d的热成像图, 叶片呈现均匀升高的淡黄色, 平均温度为24.1 ℃, 此时叶片MTD值较小, 然而较未接种之前整体温度平均仍上升了0.6 ℃。 图5(c)为接种后6 d的热成像图, 图中左侧叶片叶尖部位出现橙红色温度突变区域, 该区域10 d后也被证实为最先出现病斑的区域。 病叶其余部位表现为淡黄色, 通过图5(c)分析说明接种后6 d可初步判断病灶位置。 图中左侧叶片较未接种之前整体温度平均上升了1 ℃, MTD值增大1.2 ℃。 图5(d)为接种后9 d的热成像图, 图中右侧叶片叶中和叶基部位出现淡橙色, 较左侧叶片感病程度稍轻, 原因是基于左侧叶片更接近新的生长点, 而左侧叶片叶缘已变为明显的橙红色, 根据右侧温度棒橙红色代表24.8 ℃。 从图5的红外热线图的感病叶片温度升高的过程, 初步判断病毒侵染病灶的位置。

图5 接种前(a)和接种3天(b)、 6天(c)、 9天(d)的红外热成像图Fig.5 Infrared thermal images of leaves before inoculation (a) and 3 days (b), 6 days (c) and 9 days (d) after inoculation

图6显示了接种病毒的LI和SI组96个叶片和CG组48个叶片在接种1~9 d后叶表最大温差(maximum temperature difference, MTD) 值的变化情况。 MTD能够表征叶片表面被病毒侵染后损伤区域与完好区域间的温度差异。 正常生长的叶片在稳定的室温下始终保持极小的温度差异。 随着病毒侵染时间的推进, 接种叶片的MTD发生了显著的变化。 在接种6 d后差异达到最大, 对应的红外热像图明显观察到病斑。 第7 d开始差异缩小, 表明病毒的扩散范围增大导致病叶越来越多的区域被侵染使得整体温度上升。 根据图5的直观判别和图6的MTD值计算, 最终确定三次TCM光谱采集点选择的原则是: LI组接种后3, 6和9 d的温度突变区域的MTD值比CG组平均温度分别高出0.3, 0.7和0.5 ℃。 SI组接种后3, 6和9 d的温度突变区域的MTD值比CG组平均温度分别高出0.5, 1.2和0.8 ℃。

图6 对照组接种后叶片MTD值变化Fig.6 MTD values of leaved inoculation and control group

2.3 建模结果与讨论

支持向量机(SVM)是由AT& T贝尔实验室的Vapnik等于20世纪90年代提出的一类新型机器学习算法, 目前成为广泛使用的统计学算法[10], 兼顾泛化能力和训练误差优异性能, 在解决小样本、 非线言、 高维数、 局部极小值等模式识别问题中具有优势[11]。 SVM根据应用不同可分为支持向量分类(SVC)和支持向量回归(SVR)。 本研究采用SVC对番茄花叶病轻重程度建立识别模型。 模型采用网格搜索法参数寻优效果最佳, 与粒子群寻优算法相比能够得到较高的分类准确率, 不容易过早收敛, 避免出现局部最优。

采用主成分分析对2 151个波长点的光谱信息进行压缩, 既能够反映原始变量的大部分信息, 且所含信息互不重复, 前6个主成分所对应的累积方差贡献率已到达99%, 能解释原始数据的99%的信息。 将LI和SI组的各72个试验样品以类别按2:1比例随机划分校正集和预测集。 以校正集样品进行训练, 选用径向基函数(radial basis function, RBF)作为核函数建立SVM多类识别模型。 惩罚因子C=48.765 3, 核函数参数g=0.128 1。 以此模型对预测集样品进行回代识别, 其结果见表1。 从RCM的识别结果可以看出接种后3 d的CG, LI和SI的正确识别率分别为95.83%, 87.50%和89.58%; 接种后6 d分别为95.83%, 89.58%和91.67%; 接种后9 d分别为97.92%, 91.67%和93.75%。 而通过热成像判断定位病灶区域后采用TCM建立的识别模型中, 除了接种后3 d的一个LI样本未能识别出来, 被误判成CG样本, 识别率为97.92%外, 其余组识别率均达到了100%。 结果表明近红外光谱能够将潜育期番茄花叶病初步识别出来, 总识别率为92.59%; 而红外热成像与近红外光谱结合, 总识别率为99.77%, 能够达到更佳的识别效果。

表1 随机采集法(RCM)和热像采集法(TCM)的SVC预测识别模型结果 Table 1 Discriminating results of tomato leaves on different nitrogen stresses in the training set

叶面温度作为植物的重要生理特性和生态状况研究的基本参数是能够及时反映植物健康与否的指标之一。 李光君以西拉葡萄叶片为对象, 建立葡萄的水分胁迫指数CWSI和气孔导度指数IG的预测模型相关系数分别达到98.95%和99.01%, 证明了热成像技术与近红外光谱结合是一种可靠的无损检测方法[9]。 徐小龙等通过变温试验把叶片在低温冰箱冷藏取出后再拍摄红外热像图的办法对番茄花叶病进行检测, 得出在可见病斑出现的前3d内可检测到温度剧变的结论, 然而变温实验法在实际生产实践中执行具有一定的难度[12]

3 结 论

(1)利用红外热成像连续9 d获取潜育期番茄花叶病叶片的热像图, 从图中提取MTD值, 未染病叶片的MTD值变化很小, 而染病叶片则变化较大, 在接种6 d后差异达到最大, 第7 d开始差异缩小, 叶温整体上升。 通过MTD值结合热像图实现病灶发生区域的有效判定。

(2)对所有接种样本按RCM和TCM两种方法采集近红外光谱, 利用SVM建立番茄花叶病模型, 模型的总识别率分别为92.59%和99.77%。 结果表明近红外光谱识别潜育期番茄花叶病是可行的, 而红外热成像与近红外光谱结合的方法能够达到满意的识别效果。

(3)根据观察病害症状严重度的传统方法判定病害的程度, 主观性较大且施药晚、 药量大。 本研究利用红外热成像能够“ 早发现” 的优势和近红外光谱能够包含分子内部信息的特性在肉眼无法观察到的潜育期实现植物病害的早诊断, 建立了番茄花叶病轻重度识别模型, 为进一步研究后续的管控流程和开发精准施药奠定了一定的基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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