螺旋藻培养基配制如下: 每只三角瓶注入400 mL灭菌过的培养液, 将实验前确认为无污染的螺旋藻藻种10 mL放入三角瓶内, 置于预先设定好的不同光源组合培养箱中, 设定培养温度为25 ℃和光照周期为12L:12D。 为保证有足够量的CO₂溶于培养液中供螺旋藻生长, 利用磁力搅拌器进行搅拌以扩大藻液与空气接触面从而加大CO₂供应。

采用显微镜对螺旋藻压片进行观察研究, 分别设置放大倍数为100, 400和1 000, 显微镜观察结果分别如图1(a), (b)和(c)所示。 通过比较发现, 活螺旋藻的形态具有一定的规则, 而死亡螺旋藻则恰恰相反, 整体形态变得无序、 不规则。 由于显微镜采集的图片是经过压片后的螺旋藻的图片, 而压片会使部分螺旋藻因为离开原有的生活环境而死亡, 从而出现不规则的变形。 图1(a)中出现不规则变形的螺旋藻即为死亡的螺旋藻。

图1

Fig.1

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	图1 螺旋藻在不同放大倍数显微镜下的形态 (a): 100× ; (b): 400× ; (c): 1 000× Fig.1 Spirulina sp. under different magnification of microscope (a): 100× ; (b): 400× ; (c): 1 000×

LED光源具有波长可选择和积分通量高的优点, 在研究光照对植物生长的影响中具有广泛的应用^[6]。 本研究采用红光和蓝光的组合为螺旋藻的生长提供光源, 红光和蓝光的含量组合分别是(100%, 0%), (90%, 10%), (70%, 30%), (50%, 50%), 同时采用LED日光灯作为对照组进行分析, 不同的光源组合如图2所示。 不同光源组合保持在2500 Lux的光强下。

同一光源组合下的螺旋藻设置三组重复。 螺旋藻生长的光源组合培养箱由亚克力圆筒构成, 红光和蓝光光源灯固定在圆筒内壁保证光照均匀, 为避免外部光源影响, 采用黑色外罩包裹培养箱, 每个培养箱都单独供电。

图2

Fig.2

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	图2 不同光源组合(红光:蓝光) (a): 对照组; (b): 100%:0%; (c): 90%:10%; (d): 70%:30%; (e): 50%:50%Fig.2 The combined light sources (red light:blue light) (a): Control group; (b): 100%:0%; (c): 90%:10%; (d): 70%:30%; (e): 50%:50%

试验采用Analytical Spectral Devices (ASD)光谱仪(FieldSpec^® Handheld)采集光谱数据, 以3.5 nm的光谱分辨率采集光谱范围为325~1 075 nm的光谱。 光谱采集方式为透射, ASD光谱仪探头垂直向上, 将摇匀后的螺旋藻装入培养皿并置于探头上方, 以150 W卤素灯作为光源提供光照, 以空培养皿作为空白参照。 光谱采集次数设定为32次, 以32次采集的平均光谱作为样本的光谱。 光谱采集软件是RS3软件包, 具有光谱数据采集、 校正暗电流、 减少暗电流漂移等功能。 ASD光谱仪操作简单方便、 灵敏度高、 可对不同样本进行透射和反射操作。

1.4.1 叶绿素a含量的测量方法

取5 mL螺旋藻悬液于离心管中, 离心5 min (5 000 r· min^-1), 去清液之后, 离心管中剩余为螺旋藻。 用玻璃三角瓶装适量的95%乙醇在80 ℃水浴锅中预先加热, 取5 mL加热后的乙醇加入含有螺旋藻的离心管中, 将离心管放入水浴锅中水浴2 min, 并摇匀。 将离心管中微藻-乙醇悬浮液放置于超声水浴锅内进行避光超声震荡, 超声功率为45 kW, 时间为15 min。 超声震荡后取出离心管, 自然冷却4 h。 将冷却后的离心管离心5 min (5 000 r· min^-1, 4 ℃)。 提取上清液作为萃取液, 以95%的乙醇作为参考进行比色。 叶绿素a的含量需要根据式(1)计算得出

Chl a=13.7A665nm-5.76A649nm(1)

其中Chl a是叶绿素a的含量(mg· L^-1), A_{665 nm}和A_{649 nm}分别是分光光度计测量的比色皿在665和649 nm处的吸光度值。 单位重量的叶绿素含量由式(1)中测得的叶绿素含量与藻液中螺旋藻的干物质含量计算得到。

1.4.2 蛋白质含量的测量方法

微藻中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法测定。 此方法利用蛋白质与考马斯亮蓝溶液结合会变色的原理, 通过分光光度计测量吸光度的变化, 从而实现对微量蛋白浓度的定量测定。 考马斯亮蓝G-250呈红色, 最大吸收波长是488 nm, 结合蛋白质后会变为青色, 最大吸收波长变为595 nm。 蛋白质的含量与光的吸收值成正比, 从而可根据反应液的吸收值检测蛋白质的含量。

偏最小二乘(partial least squares, PLS)是一种有效的建模方法, 目前已在多元数据分析中取得了广泛应用, 是光谱分析领域应用最广泛的方法之一^{[7, 8, 9]}。 PLS可同时对X矩阵和Y矩阵进行因子分析, 将X, Y分解得到的变量进行排序, 其中前面的少数几个变量包含有原始数据的绝大部分信息, 具有最多的贡献率^[10], 根据对不同数量潜在变量下模型的预测结果的比较, 从而获得最优的潜在变量数。 多元线性回归(multiple linear regression, MLR)模型是基于多变量的回归模型, 探究自变量与因变量之间的线性关系, MLR仅适用于输入变量数少于样本数的情况^[11]。

本研究采用SPA提取光谱信息中对叶绿素a和蛋白质含量敏感的特征变量。 该方法可有效地解决共线性问题, 从而提取相应的特征波长^[12]。 SPA通过将波长变量映射到其它波长变量, 从而得到不同的投影大小, 将投影最大的变量选为候选特征变量, 通过不断地投影, 然后通过建立MLR模型寻找含有最低限度冗余信息的变量组合^[13]。 目前此方法已经应用在众多领域^{[14, 15, 16]}。

图3是不同红蓝光源组合培养条件下螺旋藻在可见-近红外区域内的平均吸收光谱, 由图3可以看出, 不同红蓝光源组合培养下螺旋藻液的吸光度曲线具有相同的趋势和峰谷位置, 在435, 600和680 nm附近都有一个显著吸收峰, 不同处理之间的差异主要体现在吸光度的大小上, 且在部分峰谷位置差异明显。

不同红蓝光源组合培养条件下螺旋藻中叶绿素a和蛋白质的含量如表1所示, 可以看出, 不同光源组合培养条件下单位质量螺旋藻中叶绿素a和蛋白质的含量差异较大。 叶绿素a含量按从高到低排列对应的红蓝光源含量组合依次是: (70%, 30%), (90%, 10%), (100%, 0%), 对照组, (50%, 50%)。 蛋白质含量按从高到低排列对应的红蓝光源含量组合依次是: 对照组, (70%, 30%), (50%, 50%), (90%, 10%), (100%, 0%)。

由表1可知, 不同的红蓝光组合能够影响叶绿素a和蛋白质的含量, 其原因是LED产生的红色光源波长范围为640~660 nm, 与叶绿素和光敏色素的吸收波长重合^[17], 从而有效地提供叶绿素a和b达到第一激发态的光子的能量, 红光含量高, 就可以促进叶绿素a和b达到第一激发态; LED产生的蓝色光源光谱范围为440~460 nm, 而细胞中色素能够对蓝光进行响应, 进而对细胞的生长以及新陈代谢过程产生影响, 并影响螺旋藻内成分的含量变化^[18]。 因此, 通过不同的红蓝光源组合影响细胞生长和新陈代谢, 可以影响藻类的生长和产量, 而选择最优的红蓝光源组合, 对于螺旋藻的生产利用具有非常重要的促进作用。

图3

Fig.3

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	图3 螺旋藻在不同红蓝光组合光源培养条件下的可见-近红外平均光谱Fig.3 Average visible/near-infrared spectra of Spirulina sp. cultured under different combinations of red light and blue light

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同红蓝光源组合(红光:蓝光)培养条件下螺旋藻中叶绿素a和蛋白质的含量 Table 1 The chlorophyll and protein content of Spirulina sp. under different red and blue light combinations (red light:blue light) 成分 叶绿素a/% 蛋白质/% 对照组 7.517± 0.106 0 77.6± 1.210 (100%, 0%) 8.034± 0.057 2 61.1± 0.954 (90%, 10%) 8.343± 0.077 7 66.6± 0.723 (70%, 30%) 8.633± 0.071 0 72.8± 1.814 (50%, 50%) 6.950± 0.088 9 68.7± 1.136

表1 不同红蓝光源组合(红光:蓝光)培养条件下螺旋藻中叶绿素a和蛋白质的含量 Table 1 The chlorophyll and protein content of Spirulina sp. under different red and blue light combinations (red light:blue light)

螺旋藻透射光谱采集分别在接种之后的第4 (适应期), 6, 8, 10 (生长指数期), 12和14 (生长平稳期)天进行。 在采集完透射光谱的同时, 分别测量螺旋藻中叶绿素a和蛋白质的含量, 以防止叶绿素a和蛋白质含量发生较大变化。 每种组合光源培养条件下, 又进行三次重复的光谱和成分测量, 将三次测量的结果取平均后作为一个样本, 因此最终6次试验共采集到90个样本(3× 5× 6)。 分别将样本按照2:1的比例随机分为建模集(60个)和预测集(30个), 在样本集划分时保证预测集样本的成分含量包含在建模集样本对应的成分含量范围内。 由于光谱前后端存在明显噪声, 因此选取400~1 049 nm光谱范围内(650个数据点)的值进行研究, 建立叶绿素a和蛋白质含量的预测模型, 预测结果如表2所示。 基于全谱的叶绿素a的PLS模型中, 预测集R_p为0.958、 RMSEP为0.0175, 基于全谱的蛋白质的PLS模型中, 预测集R_p为0.978、 RMSEP为0.006 30, 两个模型的输入变量分别都是650个。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 螺旋藻藻体叶绿素a和蛋白质含量的不同预测模型 Table 2 Comparison of different predictive models of chloropyll a and protein in Spirulina sp 成分 模型 变量 数 预测结果 Rc RMSEC Rp RMSEP Raw-PLS 650 0.971 0.013 9 0.958 0.017 5 叶绿素a SPA-PLS 5 0.963 0.015 7 0.943 0.021 4 SPA-MLR 5 0.967 0.014 8 0.949 0.018 8 Raw-PLS 650 0.982 0.005 53 0.978 0.006 30 蛋白质 SPA-PLS 4 0.983 0.005 52 0.974 0.006 74 SPA-MLR 4 0.983 0.005 53 0.974 0.006 74

表2 螺旋藻藻体叶绿素a和蛋白质含量的不同预测模型 Table 2 Comparison of different predictive models of chloropyll a and protein in Spirulina sp

基于全谱建立PLS模型后, 采用SPA对原始全波段光谱提取特征波长, 分别建立基于特征波长的叶绿素a和蛋白质的预测模型。 SPA选择的对叶绿素a敏感的5个特征波长分别是404, 440, 518, 662和875 nm, 对蛋白质敏感的4个特征波长分别是411, 531, 602和1 047 nm。 将选择的特征变量作为输入分别建立PLS和MLR模型, 预测结果如表2所示。 对叶绿素a含量预测的SPA-PLS模型中, 预测集中相关系数R_p为0.943, RMSEP为0.021 4; SPA-MLR模型中, 预测集R_p为0.949, RMSEP为0.018 8。 对蛋白质含量的预测模型中, SPA-PLS和SPA-MLR模型预测集相关系数R_p都是0.974, RMSEP都是0.006 74。

基于SPA选择的特征波长建立的叶绿素a和蛋白质含量的多元线性预测方程(MLR)分别如式(2)和式(3)所示

Y=3.492A404nm+12.934A440nm+9.221A518nm-22.096A662nm+5.006A875nm-2.098(2)

Y=-4.789A411nm-1.459A531nm+8.578A602nm+1.047A1047nm-0.267(3)

基于全谱和特征波长的预测模型均取得了较好的结果, 表明可见-近红外光谱结合化学计量学可用于螺旋藻液中叶绿素a和蛋白质含量的快速检测。 同时, 由表2可知, 基于全谱的模型和基于特征波长的模型预测效果相当, 而变量数从650分别减少到5和4, 波长变量减少了99%以上, 表明SPA可以有效地用于螺旋藻中叶绿素a和蛋白质含量的检测。 研究结果为螺旋藻生长状况的实时监测仪器的开发提供了方法支持。