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高浩, 王潇, 尚林伟, 赵远, 尹建华, 黄保坤. 基于二向色及透射准直的小型近红外拉曼光谱仪[J]. 光谱学与光谱分析, 2018,38(6): 1933-1937.
GAO Hao, WANG Xiao, SHANG Lin-wei, ZHAO Yuan, YIN Jian-hua, HUANG Bao-kun. Design and Application of Small NIR-Raman Spectrometer Based on Dichroic and Transmission Collimating[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2018,38(6): 1933-1937.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2018)06-1933-05  
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基于二向色及透射准直的小型近红外拉曼光谱仪
高浩1, 王潇1, 尚林伟1, 赵远1, 尹建华1,*, 黄保坤2,*
1. 南京航空航天大学生物医学工程系, 江苏 南京 210016
2. 淮海工学院, 江苏 连云港 222005

作者简介: 高 浩, 1991年生, 南京航空航天大学自动化学院硕士研究生 e-mail: Gao_Hao@live.com

收稿日期: 2017-07-03
基金: 国家自然科学基金项目(61378087, 61505079), 江苏省“六大人才高峰”资助计划(SWYY-034))资助
摘要

搭建了可用于生物医学检测的小型近红外拉曼光谱仪。 通过理论计算, 几何光路设计, 完成了系统组装。 有别于传统反射式准直结构: (1)本光谱仪色散系统采用透射式准直的方法, 将散射光投射到光栅上进行色散; (2)经二向色镜分光, 采用物镜对入射光会聚和散射光收集, 设计了与色散系统入射狭缝相匹配(共焦面)的外光路系统, 进而有效收集拉曼信号和去除杂散光; (3)实现了高分辨率(3 cm-1)、 高重复性和高灵敏度光谱检测, 检测范围500~2 200 cm-1(785 nm激发); (4)小型化设计, 整个系统尺寸约240 mm×200 mm×130 mm, 自由度高。 将此自开发小型拉曼光谱仪应用于葡萄糖和膝关节软骨的拉曼光谱测试, 获得了与大型商业拉曼光谱仪相媲美的结果, 验证了该光谱仪具有高分辨率, 高重复性和高灵敏度的优越性能, 可灵活地应用于生物医学等多领域的研究。

关键词: 小型近红外拉曼光谱仪; 生物医学; 透射式准直; 二向色镜
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Design and Application of Small NIR-Raman Spectrometer Based on Dichroic and Transmission Collimating
GAO Hao1, WANG Xiao1, SHANG Lin-wei1, ZHAO Yuan1, YIN Jian-hua1,*, HUANG Bao-kun2,*
1. Department of Biomedical Engineering, Nanjing University of Aeronautics and Astronautics, Nanjing 210016, China
2. Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China
Abstract

In order to meet professional requirements for the portable and high-performance Raman spectrometer, a small near-infrared (NIR) Raman spectrometer for biomedical detection was built in this work. In addition, assembly system was completed through the theoretical calculation, geometric optical path design. Differences from the traditional structure with reflective collimation were shown as below. (1) Transmission-based collimation method was adopted in dispersion system of the spectrometer, so the collimated scattering light projected onto the grating for dispersion. (2) Following dichroic mirror for reflection and penetration, objective lens converging the incident light and collecting the scattered light, the Raman spectrometer was designed to meet confocal plane at the slit between the collection unit and dispersion system, which is useful to collect the Raman signal and remove the stray light. (3) The spectrometer system achieves the high-resolution (3 cm-1), high repeatability and high sensitivity for spectral detection ranging of 500~2 200 cm-1 (785 excitation). (4) The entire optical system was designed in the size of ca. 240 mm×200 mm×130 mm, therefore achieving miniaturization for this NIR Raman spectrometer and flexible assembly of components. It was then used to measure Raman spectra of glucose and knee cartilage and get excellent results by comparing with that obtained by huge commercial Raman spectrometer. The results show that the spectrometer has high resolution, high reproducibility and high sensitivity, etc, thus it can be flexibly applied in biomedical and other research fields.

Keyword: Small NIR-Raman spectrometer; Biomedical; Transmission-based collimating; Dichroic
引 言

拉曼光谱除被应用于化学和材料等领域之外, 也越来越多地应用到生物医学领域[1]。 拉曼光谱可用于生物分子(包括大分子和大分子复合物)的鉴定与结构表征, 细胞、 组织及器官的活体与体外检测等, 并已取得显著进展[2]。 同时对用于生物医学研究的拉曼光谱仪的需求也日益增长。

生物医学等领域科研用的拉曼光谱仪体型较大, 安装调试和测量都有较严格的要求和限制, 不适用日常教学和便携式探测。 随着微型光电技术的发展和行业需求, 拉曼光谱仪的小(微)型化是发展的必然趋势。 现国内外已有了商业化的小(微)型便携式拉曼光谱仪产品, 商品化微型光谱仪(泛指色散型)具有光学结构紧凑化、 系统元件微型化特点, 所采用的光学结构主要有: Ebert-Fastie结构、 Czerny-Turner(C-T)结构和Littrow结构等。 其中Ebert-Fastie结构简单, 准直物镜的像差被成像物镜所抵消, 剩余彗差小, 但存在二次和多次衍射。 传统Czerny-Turner结构是由Ebert-Fastie结构演变而来, 易实现、 成本低, 但会存在球差和像散。 Littrow结构结构简单、 紧凑, 但由于入射狭缝、 出射狭缝很近, 杂散光大。

C-T结构仍是目前商用微小型光谱仪最为常用的光路结构[3], 主要有两类, 一类是非对称结构, 如卓立汉光公司的OmniEvo光谱仪; 另一类是以海洋光学 HR2000为典型的对称交叉C-T结构光谱仪。 由于传统C-T结构固有的缺陷, 近年来国内外开展了大量的研究工作, 发展出C-T的一些变形结构, 如: Shafer等[4]提出消球差、 消慧差结构; Lee[5], 薛庆生等[6]先后分别提出消像散方法; 安岩[7]提出消像散结构。 以上工作的共同点均是通过优化光学元件材料以及结构来消除彗差、 球差以及像散等, 最终权衡光谱分辨率、 灵敏度和体积大小三方面因素以实现性能上的提高。

微小型化光谱仪在追求体积小的同时, 分辨率会降低, 而高灵敏度和高分辨率的价格相对较高。 微型拉曼光谱仪不适用于科研及教学[8], 大型拉曼光谱仪则体积大、 价格高且灵活性差。 因此介于大型和微型之间的小型化拉曼光谱仪则有着广阔的市场需求。 目前, 国内的小型化拉曼光谱仪长期依赖于国外, 价格高昂, 且造成一定的市场垄断。 因此有必要自主研制小型的拉曼光谱仪, 既能满足生物医学等领域的拉曼光谱探测又可用于相关领域教学。 基于以上考量, 研制了一台基于透射式准直色散系统的小型化近红外拉曼光谱仪, 并利用此系统对不同样本进行光谱探测。 所获结果与相关报道的光谱数据相比较, 论证了本系统具有结构简单、 高分辨率、 高光谱重复性、 高灵敏度、 高性价比等优点。

1 系统原理

使用一些基本光学元件搭建了一套基于透射式准直色散系统的拉曼光谱测试系统, 如图1所示。 该拉曼光谱仪由近红外激光、 狭缝、 准直透镜、 聚焦透镜、 反射镜(Thorlab, USA)、 光栅(Newport, USA)和CCD(Andor Tech, UK)等组成。 外光路(收集光路)将收集的拉曼散射光会聚到入射狭缝, 经过准直透镜后照射到光栅, 产生的色散光再通过会聚透镜聚焦由反射镜反射经过光阑, 最后由CCD接收并记录下光谱信息。

图1 拉曼光谱测试系统Fig.1 The schmetic diagram of the NIR Raman spectrometer

激光器(IPS, USA)的激发光波长为785 nm, 该波段恰好是在生物组织光学透明窗口内[9], 不仅可增加散射深度以获取更深层次组织成分和结构信息, 同时也可减弱荧光背景的影响。 收集的拉曼散射光谱的波数范围刚好涵盖生物组织大分子如脂质、 蛋白质和核酸的特征峰位置(多集中在800~1 800 cm-1)[10]。 设计的光谱仪的主要参数如表1所示。

表1 光谱仪主要结构参数 Table 1 The main configuration parameters of the NIR Raman spectrometer
2 系统结构设计
2.1 外光路系统结构设计

现有便捷式小型化拉曼光谱仪外光路多是将光纤引入到光谱仪[11]。 由于光通量的限制, 分辨率很难有提升。 本仪器的外光路选用物镜对入射光会聚和杂散光收集, 除了有机械属性特色外, 该设计能有效收集拉曼信号和滤除杂散光。 外光路部分包括光源、 二向色镜、 物镜、 会聚透镜、 滤光片等元件以及三段套筒(旋转套筒、 安装筒和遮光筒), 所有光学元件均安装在套筒内相应的位置, 简明结构如图2所示。

图2 外光路结构示意图
1: 会聚透镜; 2: 滤光片; 3: 旋转套筒; 4: 安装筒; 5: 二向色镜; 6: 入光孔; 7: 凹面口; 8: 物镜; 9: 遮光筒Fig.2 Schematic diagram of collection unit
1: Convergent lens; 2: Filter; 3: Turnbarrel; 4: Fix tube; 5: Dichroic mirror; 6: Hole; 7: Concave; 8: Objective; 9: Baffle tube

激光经入光孔照射到二向色镜后大部分被反射至物镜, 聚焦到样品上引起较大功率的激光激发。 为避免二向色镜透过光激发安装筒内壁涂层材料, 在安装筒入光孔的对侧开有凹面口。 拉曼信号、 瑞利散射和反射激发光均被该物镜反向收集, 经过二向色镜和滤光片滤光, 用相对孔径为1/5的会聚透镜把拉曼散射光会聚到入射狭缝位置。 这其中的旋转套筒既是用来固定长通滤镜和会聚透镜, 也是更便于调节透镜的焦距位置, 使散射光准确的投射到狭缝位置, 提高光谱分辨率; 同时会聚透镜采用消色差透镜组。

2.2 色散系统设计

便捷式小型化拉曼光谱仪多采用反射式准直到光栅[3], 本文开发的近红外色散型拉曼光谱仪采用透镜作为准直镜[12], 成像物镜选用平面反射镜。 几何光学设计如图3所示(图中参数后文具体介绍), 该结构简单且容易实现仪器的安装调试和演示。 外光路会聚透镜的像方数值孔径与单色仪准直透镜的物方数值孔径相匹配, 狭缝在这两个透镜的共用焦平面位置。 光栅的放置是以主光轴上平行光入射到光栅后其衍射效率最佳为基准。 准直透镜的引入会带来色差, 故在光栅与反射镜之间加聚焦透镜。 聚焦透镜的焦点与衍射光在光栅衍射面的中心重合, 达到共光轴以抵消像差的影响。 聚焦

透镜使同一波段的衍射光聚焦在同一位点, 这样散射光被分开成一条条单色光组成的谱线。 反射镜把经过聚焦透镜会聚的单色光反射到CCD, 并均匀充满整个感应区。 为了减少杂散光的影响, 在CCD前加可调光阑。

图3 光谱仪中色散系统各部件的几何设计Fig.3 Geometric design of each component of dispersion system in NIR Raman spectrometer

2.3 系统参数设计与分辨率分析

确定系统结构设计之后, 对光学系统进行参数计算并评价分析。 光谱仪主要基本特性包括光谱工作范围、 色散率、 分辨率、 光强度及工作效率等。 分辨率是光谱仪重要的指标, 与狭缝宽度、 CCD像元个数大小和光栅的理论分辨率有关。 以光栅为色散元件的光谱系统, 其光栅方程如式(1)

d(sinα+sinβ)=mλ(1)

式(1)中, α 为入射角, β 为衍射角, d为光栅刻痕间距, m为衍射级数, λ 为入射波长。 光栅的色散本领由角色散率与线色散率来表示。 对式(1)取微分, 得到角色散率表达式

dβdλ=mdcosβ(2)

经光栅衍射到聚焦透镜聚焦, 透镜的焦距为f2, 线色散率则表示相邻波长在聚焦面可辨开的距离, 见式(3)

dldλ=mdcosβf2(3)

其中f2=f'1+f'2。 根据瑞利准则, 当两条强度分布轮廓相同的谱线的最大值和最小值相重叠时, 恰好是可以分辨这两条谱线。 光谱理论分辨率表达式为

R=λΔλ=D(sinα+sinβ)λ=Dmd(4)

式(4)中, D为矩形光栅的宽度, 实际上这里D应该为光栅在色散平面内的有效孔径宽度, 这与聚焦透镜收集经光栅色散光能力有关, 即与聚焦透镜孔径有关, 也与CCD感光面积有关。

光谱分辨率常用光谱带宽(即谱线半高宽)来定义。 聚焦镜的焦距和孔径、 狭缝和准直镜的焦距决定了系统的分辨率。 根据物像关系, 聚焦镜的焦距、 狭缝宽度和准直镜焦距与分辨率满足如式(5)关系[13]

W=f1f2δL(5)

式(5)中, W为入射狭缝宽度, f1为准直镜的焦距, 波长相距为Δ λ 的两束光, 在像面分开的距离Δ L, 变化值为δ L, Δ L是δ L在像元横向方向上的积分。

当激发波长为785 nm时, 根据目标样本散射光谱范围, 其对应的拉曼位移范围约为500~2 000 cm-1。 CCD像元个数为2 000, 像元大小为15 μ m× 15 μ m, 可以估计每个像素包含的拉曼位移的大小, 即1 500/2 000=0.75 cm-1。 如果分辨率对应的像素个数约为n个, 那么分辨率为0.75n, 像平面上δ L=15 μ m× n=15n μ m, 已知f1/f2=0.66, W=50 μ m代入式(5), 可求得分辨率约为3 cm-1。

其中光栅的安装是灵活可转动的, 可实现不同波长范围内分光, 适用于一定波长范围内不同激发波长, 自由度高。 透射式结构准直透镜与聚焦透镜都在光栅的同一侧, 物理空间上不接触, 准直透镜到光栅是平行光, 因此原则上准直透镜与聚焦透镜到光栅的距离没有限制。 但要保证一级衍射不被准直透镜遮挡。

2.4 系统校正

根据上述参数调整优化系统结构, 并进行机械设计和加工, 其中机械部件可灵活拆调, 方便安装和演示。 用低压汞灯的发射谱线进行光谱校正, 多项式拟合法定标波长。 定标过程用CCD自带的Solis软件完成。 图4是调整后检测到的低压汞灯谱线图, 图中实线框图是虚线框内谱线的放大, 以841和843 nm两个谱峰为例, 可见两者谱线半高宽在0.2 nm左右, 整个光谱范围为800~930 nm。 谱线半高宽用以表示光谱仪分辨率, 则该系统分辨率约3 cm-1, 与理论上相等, 达到设计目标。

图4 汞灯谱图Fig.4 Spectrogram of mercury lamp

3 实验与结果
3.1 材料与过程

研制的光谱仪光路设计尺寸大小约240 mm× 200 mm× 130 mm, 满足小型化要求, 最后封装在黑色暗箱里。 光谱仪主要由激光器、 三维样品平台、 外光路收集系统(含支架)、 色散系统和计算机等部件组成。 分别采集葡萄糖和比格犬膝关节软骨的拉曼光谱。 将待测样品放置在三维平台上, 并设定合适的曝光时间, 移动三维平台以调整样品与物镜间距离, 使得物镜的焦平面落在待测样品上。

3.2 结果及光谱分析

系统的波峰重复性, 由多次测量结果的偏差值来表征。 用葡萄糖粉末进行测试, 每隔3 min采集10次, 每次曝光时间为3 s, 结果如图5(a)所示。 在整个光谱范围内, 多次测量所得拉曼谱的重复性非常好。 以图5(a)阴影中917和927 cm-1双峰为例进行局部放大[图5(b)], 多次采集的葡萄糖粉末谱线的峰位置偏差在1 cm-1左右, 进一步展示了良好的光谱重复性和稳定性。 此外, 本实验还检测到一些常规拉曼光谱仪[14]没有检测到的谱峰(如1 105 cm-1), 说明光谱仪具有较高的灵敏度。

图5 光谱仪重复性测试的葡萄糖拉曼光谱
(a): 十次重复采集光谱图; (b): 阴影范围谱带放大图Fig.5 Raman spectral measurements of glucose to test the reproducibility of the NIR Raman spectrometer
(a): Raman spectra of glucose measured ten times; (b): magnified portion of the spectrum in the shaded region of Fig.5(a)

图6所示是该光谱仪所采集的膝关节软骨拉曼光谱图, 采集时间20 s。 其中, 1 200~1 320 cm-1(酰胺Ⅲ ), 1 595~1 700 cm-1(酰胺Ⅰ ), 1 400~1 470 cm-1(亚甲基团)来自软骨中的有机组分(胶原和蛋白多糖)。 磷酸基团(P O43-)和碳酸基团(C O32-)主要代表矿物质成分, 磷酸基团具有四种不同频率振动模式: ν 1(960~961 cm-1), ν 2(430~450 cm-1), ν 3(1 035~1 048和1 070~1 075 cm-1), ν 4(587~604 cm-1)。 碳酸基团有两种振动模式, 分别在1 073 cm-1(B型碳酸盐的ν 1)和1 103 cm-1(A型碳酸盐)处, 见图6(a)。 对比相关文献报道的软骨组织拉曼光谱[15], 自搭建系统能检测到所有已知的光谱信息, 并获得了与其他商业拉曼光谱仪相一致的结果。 谱图中酰胺Ⅲ 带有两个特征峰, 两个峰比率(1 240/1 320 cm-1)可作为判别胶原二级结构破坏依据[16, 17], 正常软骨内该比率较大, 体现在1 240 cm-1谱峰较1 320 cm-1偏高; 而损伤软骨内则小, 1 240 cm-1谱峰比1 320 cm-1低, 见图6(a)和(b), 实验说明该系统适用于生物医学等多领域的研究和检测。

图6 关节软骨拉曼光谱图(基线已校正)
(a): 正常软骨拉曼光谱图; (b): 损伤软骨拉曼光谱图Fig.6 Raman spectra of articular cartilage
(a): Raman spectrum of normal cartilage; (b): Raman spectrum of damaged cartilage

4 结 论

开发了透射式准直色散型的近红外拉曼光谱仪, 外光路采用物镜、 二向色镜和透镜的光路设计, 实现共光轴。 物镜能有效激发、 去除杂散光和收集散射光。 内光路准直物镜采用透式准直的光路设计, 可避免产生严重的像散, 慧差。 透镜带来的色差, 用消色差透镜组来消除。 最终实现了高性能的近红外拉曼光谱仪搭建。 仪器光路结构简单, 占用空间小, 实现了小型化。 各元件安装灵活, 可调性强, 拆解方便, 自由度高。 葡萄糖和软骨实验测试结果证明该系统具备高分辨率、 高灵敏度、 高重复性(稳定性)。 系统在结构设计、 装调和性能上都具有一定优势, 能很好地满足科研及教学的应用需求, 具普遍的科研价值和较大的市场潜力。

The authors have declared that no competing interests exist.

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