猪粪采自西北农林科技大学畜牧教学试验基地, 秸秆采自杨凌周边农田, 两种物料按照2∶ 1进行堆肥, 采用反应器强制通风堆肥, 反应器中总质量约100 kg。 共采集8个阶段样品, 分别是堆肥的第1, 4, 8, 15, 22, 29, 36和43天, 记为Z1, Z4, Z8, Z15, Z22, Z29, Z36和Z43, 堆肥物料理化指标见表1。 每个阶段样品采集约300 g, 样品用塑料自封袋和冰袋混合保存并运输至北京。 样品分为两部分, 一部分经过-54 ℃冻干后研磨过100目筛, 得到前处理样品保存在-20 ℃冰箱中。 另一部分样品直接保存在同一个-20 ℃冰箱中。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 堆肥样品物料理化指标 Table 1 Characteristics of the composting samples substrates 参数 猪粪 秸秆 Moisture/% 63.12± 1.10 6.45± 0.20 pH 8.00± 0.06 6.57± 0.14 EC/(mS· cm-1) 5.41± 0.11 2.72± 0.26 OM/% 73.04± 0.20 90.91± 0.88 TP/(g· kg-1) 29.38± 1.70 4.18± 0.37 TKN/(g· kg-1) 26.11± 0.09 1.03± 0.07 TK/(g· kg-1) 12.54± 0.39 0.80± 0.00

表1 堆肥样品物料理化指标 Table 1 Characteristics of the composting samples substrates

猪粪堆肥含水率采用差重法测定, 用坩埚盛装堆肥样品分别称量坩埚和样品净重, 在105 ℃条件下加热4 h, 待冷却至常温后再称量样品净重计算出样品含水率; 采用纳式试剂法测定水溶性氨氮(N H4+-N); 水溶性硝氮(N O3--N)测定则是采用紫外分光亮度计法; 猪粪堆肥pH值测定通过将猪粪堆肥样品按照1∶ 25加入超纯水, 150 r· min^-1震荡24 h后用便携式pH计测定上清液pH值。

将冻干研磨过筛后的猪粪堆肥样品按照1∶ 15的比例加入0.5 mol· L^-1 HCl, 置于暗处反应以去除无机碳, 每隔4 h摇匀, 每次摇匀后打开盖子让CO₂逸出。 反应20 h后将样品用纯水洗涤4遍, 冻干后的样品用于元素分析。 堆肥样品的总有机碳(total organic carbon, TOC), N, H, S的含量采用varioELcube型元素分析仪测定。

猪粪堆肥DOM提取按照文献[6]提供的方法。 将冻干研磨后的猪粪堆肥样品按照1 g∶ 10 mL的比例加入纯水, 在室温下250 r· min^-1震荡24 h, 10 000 r· min^-1离心10 min, 取上清液再过0.45 μ m滤膜, 得到DOM母液。 将DOM母液加纯水稀释100倍后, 使用德国耶拿公司的multi N/C-2100型TOC仪测定其DOC浓度, 仪器标准偏差< 2%, 再计算出DOM母液DOC浓度。

1.4.1 DOM紫外-可见光光谱扫描

紫外-可见光光谱测定采用美国尤尼柯UV-2820型紫外-可见光分光光度计, 扫描波长范围为190~700 nm, 扫描间距为1 nm。 将猪粪堆肥DOM母液加纯水稀释使得DOC调整为20 mg· L^-1, pH值参数见表2, 并以纯水作为空白对照, 扫描紫外-可见光全谱。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 堆肥样品基础理化指标 Table 2 Physicochemical properties of the compost samples 堆肥 阶段 pH 值 硝氮 /(mg· g-1) 氨氮 /(mg· g-1) DOC /(mg· L-1) 含水率 /% Z1 7.29 2.104 4.603 2 191 77.70 Z4 7.73 0.644 3.706 1 778 57.79 Z8 8.13 0.435 2.319 1 080 52.52 Z15 7.60 2.104 3.053 1 192 58.47 Z22 7.57 1.269 2.238 1 216 63.37 Z29 7.88 1.269 1.993 1 180 49.08 Z36 7.90 0.852 2.727 757.5 58.81 Z43 7.49 0.435 1.340 901.5 49.61

表2 堆肥样品基础理化指标 Table 2 Physicochemical properties of the compost samples

1.4.2 DOM三维荧光光谱扫描

三维荧光光谱采用日立公司Hitachi F-7000型荧光亮度计进行测定。 激发光源: 150 W氙弧灯; PMT电压: 700 V; 信噪比> 110; 狭缝宽带: Ex=10 nm; Em=10 nm; 响应时间: 自动。 三维荧光光谱测定时激发波长E_ex=200~450 nm; E_em=280~550 nm, 扫描速度2 400 nm· min^-1。 DOM母液样品加纯水稀释至DOC=5 mg· L^-1, pH值见表2, 进行三维荧光光谱扫描, 并用纯水作为空白对照。

三维荧光区域体积积分是利用matlab将三维荧光谱图中不同区域的体积进行积分计算, 得到不同区域所代表的有机组分含量相对大小。 用SPSS 18.0作相关性分析, 并设定p< 0.05为显著的。

堆肥基础理化指标如表2所示, 可以看出在堆肥过程中有机质结构变化受到微生物新陈代谢和非微生物过程的化学反应影响, 但无论是微生物影响还是非微生物影响都受到堆肥环境条件控制, 因此能通过控制堆肥理化指标, 达到调控堆肥过程有机质变化。

由表2可知, 在整个堆肥周期中pH值较稳定, 呈弱碱性有利于微生物生长。 堆肥前期温度上升会加快水分挥发, 导致堆肥含水率下降。 在堆肥过程中氨氮含量始终高于硝氮含量, 而氨氮、 硝氮含量均呈现下降趋势。 堆肥环境存在厌氧好氧条件, 使得堆肥过程中发生硝化反硝化反应, 同时一些含氮有机物中氮素也可能被转化为氨氮、 硝氮, 而氨氮呈弱碱性, 对堆肥的pH值在呈弱碱性(见表2)有一定贡献。

不同堆肥阶段样品的元素组成如表3所示, C是含量最高的元素, 但在整个堆肥过程中C含量随着时间显著下降, 从开始的30.24%降低至末期的25.31%。 H含量也呈下降的趋势, 但H含量最高的时间是在堆肥的第4天为4.838%, 到末期降低为3.881%。 N含量在堆肥过程中波动幅度比较大, 但是整体趋势减少, 而S在整个堆肥过程中的含量呈上升的趋势。 原子比值能提供关于堆肥过程中有机质变化的有用信息, 如表3中所示, 堆肥样品的H/C比值范围在1.785 5~2.052 9之间, 腐殖质的H/C比值通常在1.0附近, 说明其主要是芳香族骨架的化学结构。 然而, 本研究中H/C比值(> 1.7)较高, 这说明本堆肥样品中脂肪族官能团的含量较高。 在堆肥过程中H/C比值变化明显, 在整个堆肥过程中呈下降趋势, 表明在堆肥过程中芳香族化合物含量增加, 而脂肪族官能团减少, 这一变化方式与紫外-可见光光谱特征参数SUVA₂₅₄[图4(a)]、 E₂/E₂[图4(b)]表现一致。 同时在堆肥过程中, N/C原子比仅有略微提升, 但在堆肥过程中的变化较大。 而S/C比值也呈上升趋势, 但增长速率高于N/C, 表明含硫有机物的生物降解速率低于一般的含碳化合物。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 堆肥样品元素组成分析 Table 3 Elemental compost samples analysis Name 元素组成/% 原子比 N[%] C[%] H[%] S[%] N/C H/C S/C Z1 3.41 30.24 4.676 0.45 0.096 7 1.855 6 0.005 6 Z4 3.27 28.28 4.838 0.38 0.099 1 2.052 9 0.005 0 Z8 2.76 26.63 4.427 0.38 0.088 8 1.994 9 0.005 4 Z15 3.13 25.52 4.134 0.39 0.105 1 1.943 9 0.005 7 Z22 3.07 24.58 3.919 0.46 0.107 1 1.913 3 0.007 0 Z29 3.14 26.37 4.174 0.50 0.102 1 1.899 4 0.007 1 Z36 2.79 25.72 3.827 0.53 0.093 0 1.785 5 0.007 7 Z43 2.90 25.31 3.881 0.54 0.098 2 1.840 1 0.008 0

表3 堆肥样品元素组成分析 Table 3 Elemental compost samples analysis

2.2.1 堆肥可溶性有机碳与总有机碳变化特征

堆肥过程中可溶性有机碳和总有机碳的变化如图1(a)所示, 在堆肥的前8天内, 可溶性有机碳和总有机碳均迅速下降, 说明在堆肥前期各类微生物与非微生物反应剧烈。 在第8天到第29天之间, 总有机碳继续降低, 但可溶性有机碳略上升。 可能与该阶段堆肥含水率上升有关(表2), 含水率升高使总有机碳中一些不可溶有机质在微生物的作用下转为可溶性有机碳。 从图1(a)中可以看出, 在第29天时, 总有机碳含量有所上升, 可能是因为堆肥过程中添加的有机质碳源所导致, 之后总有机碳持续下降。 而可溶性有机碳则是在第36天下降至最低点。

图1

Fig.1

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	图1 可溶性有机碳和总有机碳含量(a); 可溶性有机碳与总有机碳之比(b)Fig.1 Contents of DOC and TOC(a); DOC/TOC(b)

有机质在堆肥过程中持续被消耗, 总有机碳和溶解性有机碳均减少, 但是两者降解速率却不同。 为了比较两者的降解速率, 计算出溶解性有机碳和总有机碳的比值(DOC/TOC)见图1(b), 同时计算出两者的单位时间降解率如图2所示。 由图1(b)可知, 在前8天中, 溶解性有机碳的降解率要远高于总有机碳, 而且DOC/TOC(图2)也在降低。 这说明堆肥初期, DOM是活跃的有机质, 微生物新陈代谢和堆肥内部的化学反应都与其有着密切的联系, 所以DOM的降解速率要远高于其他有机质。 在图2中可以看出, 在22天溶解性有机碳降解率为-7.28%, 说明该阶段内溶解性有机碳增加, 而总有机碳降解率也略降低, 这因总有机碳含量降低所导致的。 这阶段DOC/TOC的增加是由于溶解性有机碳含量增加, 而总有机碳仍然在降解。 在22天到36天内, DOC/TOC[图1(b)]进一步降低至0.295, DOM作为活跃部分继续参与微生物和非微生物过程被降解, 而总有机碳降解率只是略降低。 在堆肥末期, DOC/TOC略增加, 堆肥中总有机质降低, 而溶解性有机碳却略上升。 在堆肥过程中, 可溶性有机碳降低了58.88%, 总有机碳降低了16.30%。 由以上结果可以看出, 虽然DOM在堆肥总有机质中含量不高, 但DOM却是堆肥有机质中最活跃的部分。 堆肥中总有机质和DOM的降解主要集中在前期, 可能是由于前期有机质含量丰富, 基数较大, 微生物反应与化学反应均较为活跃。

图2

Fig.2

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	图2 DOC, TOC降解率Fig.2 Degradation rate of DOC, TOC

2.2.2 堆肥DOM芳香性及芳环取代基变化特征

有机质化合物的紫外-可见光吸光度与分子结构有密切联系。 不同堆肥阶段DOM紫外-可见光光谱图如图3所示。 各个堆肥阶段DOM吸光度曲线呈平缓逐渐下降趋势, 无明显吸收峰出现, 但是在280 nm附近出现一个吸收肩峰。 280 nm附近出现吸收平台与腐殖质物质中木质素磺酸及其衍生物有关, 而且随着不饱和共轭双键结构和腐殖质芳香族化合物的增加, 吸光度也增强^[7]。 由此可见, 随着堆肥的进行有机质的芳香度和不饱和度都在增加。

图3

Fig.3

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	图3 紫外-可见光光谱Fig.3 Changes of UV-Vis spectra in DOM during composting

SUVA₂₅₄(=A₂₅₄× 100/TOC)与有机化合物中的C=C键有关, 一般认为该值越高, 有机质的芳香程度越高, 而SUVA₂₈₀(=A₂₈₀× 100/TOC)则与有机质分子量显著相关^{[8, 9]}。 由图4(a)可见, 在整个堆肥的过程中, SUVA₂₅₄呈增大趋势。 其中堆肥前15天, SUVA₂₅₄一直处在上升期, 第4天后SUVA₂₅₄快速上升, 随后上升速度放缓。 这可能是由于在堆肥前期, 溶解性有机质含量丰富, 堆肥微环境利于有机质进行聚合作用导致有机质芳香性迅速提高。 而SUVA₂₈₀的变化趋势与SUVA₂₅₄一致, 说明DOM中大分子有机质含量增多。 中期15天后, SUVA₂₅₄开始下降, 在22天到29天这段时间内SUVA₂₅₄略升高, 这可能是由于该阶段pH值(表2)降低, 导致堆肥环境中微生物种群结构发生变化使得堆肥有机质中的结构发生变化^[10]。 堆肥过程中有机质转化有两个作用, 微生物的新陈代谢活动和堆肥有机质的物理化学反应。 在堆肥后期, pH值降低, 可能更利于堆肥腐殖质类物质降解, 导致SUVA₂₅₄降低。 而SUVA₂₈₀的变化显示DOM中大分子有机质含量和有机质整体芳香性降低。 SUVA₂₅₄和SUVA₂₈₀的最大值均在堆肥后期的36天, 这段时间堆肥DOM有机质的芳香性和大分子有机质含量达到最大值。 这可能是在该阶段堆肥pH值(表2)升高环境中碱性加强, 微生物种群更适宜碱性条件, 同时微生物更容易利用DOM中小分子有机物, 而对大分子有机物的利用率较低, 因此有大分子有机物积累^[11]。 在堆肥的末期DOM中大分子有机质含量增加, 芳香性提高, 堆肥稳定化程度加强。

图4

Fig.4

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	图4 堆肥不同阶段DOM紫外-可见光谱图特征参数SUVA254, SUVA280(a)和E253/E230(b)变化Fig.4 Evolution of the SUVA254, SUVA280 (a) and E253/E230 (b) from the UV-Vis spectra of DOM during composting

堆肥DOM中芳环取代基种类和取代程度与DOM在253与203 nm吸光度之比有关, 记为E₂/E₂(=A₂₅₃/A₂₀₃)。 芳环上取代基中的羰基、 羧基、 羟基、 脂类含量增多时, E₂/E₂会增大; 芳环取代基中脂肪链含量增多时, E₂/E₂会降低。 如图4(b)所示, 在堆肥的前8天内, E₂/E₂呈增长的趋势, 在开始的4天内增速较快, 之后增速放缓。 这可能是堆肥前期含水率(表2)较高, 而堆肥pH为碱性条件, 能中和微生物在降解有机质时产生的小分子有机酸, 有利于微生物种群繁衍^[12]。 DOM与微生物作用密切, 在微生物的新陈代谢作用下, 芳环上含氧基团含量增加。 第8天后E₂/E₂开始下降直至15天后E₂/E₂又缓慢升高, 但在29天后急剧上升至最高点为0.357, 末期又下降为0.296。 在堆肥过程中E₂/E₂总体呈上升趋势, 有机质中的脂肪链烃被脱氢加氧, 说明在堆肥过程中整体是一个有机物被氧化的过程。

2.2.3 堆肥DOM组分分析

3D-EEM光谱的特定波长荧光强度数据, 能有效显示DOM的组分特征。 根据He等^[13]的研究, 3D-EEM可分为5个区域, Ⅰ 区为类酪氨酸物质荧光峰; Ⅱ 区为类色氨酸物质荧光峰; Ⅲ 区是类富里酸荧光峰; Ⅳ 区的物质则与微生物代谢产物和微生物残体有关; Ⅴ 区是类腐殖质物质产生的荧光峰。 其中Ⅰ 区和Ⅱ 区可统一为类蛋白物质荧光峰区, Ⅲ 区和Ⅴ 区均为类腐殖质荧光峰区。 利用matlab通过removescater工具包除去瑞利散射和拉曼散射, 再进行区域体积积分。

图5是各个阶段堆肥DOM的3D-EEM图, 由图中可发现, 在堆肥初期阶段, Ⅰ 区和Ⅱ 区为类蛋白物质主要荧光峰。 在堆肥初期由于猪粪中粗蛋白、 氨基酸类物质尚未被微生物大量分解, 堆肥中有机质聚合度低, 类腐殖质物质尚未明显出现。 随着堆肥的进行, 类腐殖质类物质开始逐渐出现, Ⅰ 区类酪氨酸物质荧光峰逐渐降低, Ⅱ 区类色氨酸物质荧光峰仍然存在, 该区域荧光到堆肥末期也存在, 其变化在图中并不明显。 在堆肥末期类腐殖质类物质大量出现, 但Ⅲ 区和Ⅴ 区未出现明显的荧光峰。

图5

Fig.5

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	图5 堆肥DOM三维荧光图Fig.5 3D-EEM spectra of DOM during composting

将各个区域荧光强度进行区域体积积分, 所占百分比分别记为P_{(i, n)}。 所得的结果如图6(a)所示, 在堆肥初期P_{(Ⅰ , n)}和P_{(Ⅱ , n)}代表的类蛋白物质, 其荧光强度体积百分比在整个堆肥周期中处在较高的水平。 在堆肥的第1天时类酪氨酸和类色氨酸均是堆肥周期的最大值分别达到了15.96%和18.14%。 随着堆肥的进行类蛋白物质逐渐被微生物降解, 或发生聚合作用等, 使得类蛋白物质含量逐渐降低。 其中P_{(Ⅰ , n)}区的类酪氨酸降低趋势比P_{(Ⅱ , n)}区的类色氨酸更为明显, 前者由初期15.96%降低至末期的5.53%, 而且堆肥15天时类酪氨酸已经降解至10.05%, 这说明堆肥过程中类酪氨酸的降解主要发生在堆肥的前期, 可能是在前期堆肥含水率(表2)较高, 这类小分子更容易被微生物利用^[11]。 P_{(Ⅱ , n)}所表示的类色氨酸则由第1天的18.14%降低至末期的11.27%。 这一现象与He等^[14]实验类似, 这可能是类蛋白物质在降解的时候, 类酪氨酸物质更容易被微生物利用, 所以在前期降解的速率更快。 在最初组分中微生物代谢产物及其残体区所占百分比为25.45%, 是所有区域中占比最多的物质, 直至堆肥的末期含量降低为17.96%, P_{(Ⅳ , n)}的变化趋势与类蛋白物质的变化趋势一致, 均随着时间的延长而平缓降低。 说明在堆肥的过程中微生物残体及微生物代谢产物也发生了结构变化, 可能也转为了类腐殖质物质。 P_{(Ⅴ , n)}和P_{(Ⅲ , n)}是类胡敏酸和类富里酸物质荧光强度百分比, 与前面几个区域的变化趋势不同, 类腐殖质物质随着堆肥的进行其所占百分比在不断提升。 P_{(Ⅴ , n)}由最初的22.77%提升至44.62%, 增幅将近一倍左右, 相比较而言P_{(Ⅲ , n)}的含量虽然也是呈现增长的趋势, 但是其增幅远不如前者, 只由最初17.67%增长到20.62%。 这可能在堆肥过程中类腐殖质物质逐渐形成, 有机物会发生碳骨架缩合, 形成分子量较大的类胡敏酸物质, 这一过程是堆肥中的主要物质结构转化趋势, 同时类富里酸物质也会形成, 但并非堆肥过程中主要的有机组分变化过程。

图6

Fig.6

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	图6 堆肥不同阶段DOM有机组分的荧光强度体积积分百分比(a)和相对含量(b)的变化Fig.6 Changes of fluorescence intensity volume fraction (a) and relative content (b) of DOM organic components in different stages of composting

堆肥过程中有机质呈现出动态平衡的状态, 类腐殖质物质不断生成, 也在不断降解, 但生成速率高于降解速率, 所以类腐殖质物质荧光强度百分比随着堆肥进行而升高。 由于在堆肥过程中DOC的浓度是逐渐降低的, 而三维荧光测样品时选定的TOC浓度是统一的, 因此用DOC乘上荧光强度百分比, 记为G_{(i, n)}表示DOM各类有机组分相对含量, 如图6(b)所示。 在堆肥过程中G_{(Ⅰ , n)}, G_{(Ⅱ , n)}和G_{(Ⅳ , n)}在前8天内急剧下降, 说明类蛋白物质主要在前期被降解。 而G_{(Ⅲ , n)}和G_{(Ⅴ , n)}的降解速率要低于前者, 这可能由于微生物更容易降解类蛋白物质。 到都堆肥末期, 各类有机质含量均下降, 但类胡敏酸物质的相对含量降低较少。 一方面是因为类胡敏酸降解的较慢, 另一方面则是类蛋白物质会转化为类胡敏酸物质。

堆肥过程中DOM的类蛋白物质逐渐转化为类腐殖质类物质, 从而使得堆肥产品DOM能够作为一种良好的外电子穿梭体, 介导微生物将电子传递至有机物污染物或重金属, 从而改变这些污染物的赋存形态, 使之变为无毒或低毒^[15]。 因此, 阐明堆肥过程中DOM结构演变可为拓展堆肥产品的环境效应提供参考。