DXRxi显微拉曼成像光谱仪(Thermo Fisher Scientific, USA); XS105 DualRange 分析天平(精密度: 0.01 mg, METTLER TOLEDO, Switzerland); SLR温控型红外快速加热板(Wiggens公司); Nano-ZS90 纳米粒度仪(Malvern Instruments Ltd, UK); KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); WFH-203B 型三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司); 硅胶GF₂₅₄铝合金薄层板(Merk, Germany)。 三唑仑(批号: 171230)、 艾司唑仑(批号: 171219)、 氯硝西泮(批号: 171227)、 奥沙西泮(批号: 171229)对照品均购自中国食品药品检定研究院。 美通宁片(批号: 160401)、 恬静胶囊(批号: 20160603)、 睡好片(批号: 15110010)、 纽斯葆牌褪黑素片(批号: 6A175)、 野酒花牌改善睡眠胶囊(批号: 20160402)均为市售改善睡眠类保健食品。 硝酸银、 柠檬酸三钠、 乙酸乙酯、 无水乙醇、 环己烷等均为分析纯。 实验用水为纯化水。

1.2.1 银胶溶液的制备

称取硝酸银90 mg, 溶于500 mL水中加热至沸腾, 加入1%柠檬酸钠溶液10 mL, 然后保持沸腾1 h, 冷却, 得银胶溶液。 取上述银胶溶液4 mL, 离心后移去2 mL上清液, 得到2倍浓缩的银胶溶液, 4 ℃保存备用。

1.2.2 溶液的制备

对照品溶液: 精密称取艾司唑仑、 奥沙西泮对照品各适量, 分别加甲醇配制1 mg· mL^-1的溶液; 精密称取三唑仑、 氯硝西泮对照品各适量, 分别配制0.5 mg· mL^-1的甲醇溶液, 备用。

样品溶液: 取一次口服剂量的样品, 研细, 加入甲醇2 mL溶解, 超声15 min, 离心后取上清液, 浓缩至 1 mL, 备用。

模拟阳性样品溶液: 取某改善睡眠类保健食品样品(经齐齐哈尔市食品药品检验检测中心检测不含有以上四种对照品, 可作为阴性样品)适量, 研细, 精密称取三唑仑、 艾司唑仑、 氯硝西泮、 奥沙西泮对照品适量加入样品中, 加入甲醇2 mL溶解, 超声 15 min, 离心后取上清液, 浓缩至1 mL, 使四种化学成分与相应的对照品一致, 备用。

1.2.3 TLC-SERS检测

分别吸取对照品溶液、 阴性样品溶液以及模拟阳性样品溶液适量, 点于同一GF₂₅₄硅胶板上, 以环己烷-乙酸乙酯-乙

醇(5∶ 3.5∶ 2)为展开剂, 室温条件下, 展开, 取出晾干, 在UV_{254 nm}紫外灯下检视定位, 分别将对照品与其R_f值相同处的斑点滴加4 μ L银溶胶, 采用显微拉曼成像光谱仪进行检测相应的SERS。 三唑仑、 氯硝西泮对照品溶液浓度较低, 应采用乙醇对相应色谱斑点原位浓集后, 在浓集点处滴加4 μ L银胶溶液, 其他操作同上。

拉曼光谱仪工作条件: 激发光波长: 780 nm激光; 放大倍数: × 10; 扫描范围: 50~3 300 cm^-1; 图像像素大小100.0 μ m; 光阑: 50 μ m共聚焦针孔; 扫描方式: 区域面扫; 激光功率: 24.0 mW; 曝光时间: 0.2 s; 曝光次数: 20; 平滑点数为 5; 采用OMNICxi软件进行数据处理; Savitzky-Golay 平滑; Origin Pro 8.0制图。

参照国家药品标准和相关文献方法, 对TLC展开条件进行比较及优化, 实验中分别考察了三个展开系统对三唑仑、 艾司唑仑、 氯硝西泮及奥沙西泮的展开情况: (1) 正庚烷-氯仿-无水乙醇-乙酸乙酯(5∶ 2∶ 2∶ 1.5); (2) 氯仿-苯-丙酮-甲醇(5∶ 5∶ 3∶ 1); (3) 环己烷-乙酸乙酯-甲醇(5∶ 3.5∶ 2), 根据四种化学成分的分离效果与展开剂的毒性大小, 最终选择(3)作为本试验的TLC展开剂。

2.2.1 银溶胶粒径及电势变化

从银溶胶制备之日起, 每隔七天采用纳米粒度仪分别测定所制备的银胶溶液粒径(Size)、 电势(Zeta)。 如图1及图2所示, 银溶胶放置0~21 d天, 粒径与电势变化无显著性差异(p> 0.05), 其中粒径约为16.0 nm, 电势约为-35.0 mV, 说明所制备的银胶溶液纳米颗粒分布较为均匀, 具有良好的稳定性。

图1

Fig.1

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	图1 银胶溶液粒径变化 与0 d 相比, 代表差异不显著(p> 0.05); * 代表差异显著(p< 0.05); * * 代表差异极显著(p< 0.01)Fig.1 Particle size change of silver colloid solution Compared to 0 d, was no significant difference (p> 0.05); * was significant difference (p< 0.05); * * was very significant difference (p< 0.01)

图2

Fig.2

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	图2 银胶溶液电势变化 与0 d 相比, 代表差异不显著(p> 0.05); * 代表差异显著(p< 0.05); * * 代表差异极显著(p< 0.01)Fig.2 Potential change of silver colloid solution Compared to 0 d, was no significant difference (p> 0.05); * was significant difference (p< 0.05); * * was very significant difference (p< 0.01)

2.2.2 银胶溶液放置时间对TLC-SERS的影响

参照1.2.3节进行实验, 从银胶溶液制备之日起, 每隔两天对艾司唑仑TLC-SERS进行检测, 比较分析不同放置时间的银溶胶对谱图的影响。 如图3所示, 银溶胶放置0~12 d内, 各时间段艾司唑仑的 TLC-SERS峰型基本一致, 峰强略有不同, 说明所制备的银胶溶液在短期内可以重复使用, 具有良好的稳定性。

图3

Fig.3

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	图3 银胶溶液放置时间对TLC-SERS的影响Fig.3 Effect of storage time of silver sol on TLC-SERS

2.2.3 检测时间对TLC-SERS的影响

参照1.2.3节实验, 以艾司唑仑为例, 在TLC斑点位置滴加2 μ L银胶溶液, 待银胶溶液挥干后, 分别在0~1 h内每隔10 min检测一次, 观察谱图变化。 由图4可见, SERS信号基本无明显变化, 说明检测斑点在经TLC分离、 UV_{254 nm}定位后, 1 h内检测稳定性良好。

图4

Fig.4

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	图4 检测时间对TLC-SERS的影响Fig.4 Effect of detection time to TLC-SERS

以532 nm激光为激发光源, 空白银溶胶在1 200~1 800 cm^-1处有较强的信号; 以 780 nm激光为激发光源, 空白银胶几乎没有信号。 为了防止银胶溶液信号对目标物检测信号的干扰, 实验中选用 780 nm激光作为激发光波长, 见图5。

图5

Fig.5

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	图5 不同激发波长条件下空白银溶胶拉曼光谱图Fig.5 The Raman spectra of blank silver colloids under 780 nm (red) and 532 nm (blue)

将对照品(三唑仑)溶液、 样品溶剂(甲醇)、 空白银胶溶液分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上, 参照1.2.3节进行实验, TLC斑点处检测 SERS信号。 如图6所示, 空白银溶胶及样品溶剂均无明显的SERS信号, 而对照品与对照品粉末有相近的拉曼特征峰信号, 说明甲醇溶剂与银胶溶液对目标成分SERS几乎无干扰。

图6

Fig.6

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	图6 三唑仑、 甲醇、 空白银胶溶液的TLC-SERS(a)及三唑仑TLC-SERS显微拉曼成像(b) a: 空白银胶溶液; b: 甲醇; c: 三唑仑溶液; d: 三唑仑晶体Fig.6 TLC-SERS of triazolam, methanol and blank silver gum solution (a) and Micro Raman mapping of TLC-SERS of triazolam (b) a: Blank silver colloid solution; b: Methanol; c: Triazolam solution; d: Triazolam crystal

如图7所示, 三唑仑、 艾司唑仑、 氯硝西泮及奥沙西泮的R_f值分别为0.24, 0.35, 0.72和0.80, 且可与保健食品主要成分(褪黑素与维生素B₆)及其他基质初步分离。

图7

Fig.7

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	图7 阴性样品、 模拟阳性样品及对照品的TLC 1: 三唑仑; 2: 艾司唑仑; 3: 氯硝西泮; 4: 奥沙西泮; 5: 模拟阳性样品; 6: 阴性样品Fig.7 The TLC of negative samples, simulative positive sample and reference substances 1: Triazolam; 2: Estazolam; 3: Clonazepam; 4: Oxazepam; 5: Simulative positive sample; 6: Negative sample

如图8所示, 经TLC分离的阳性样品中四种化学药物的SERS图谱与相应对照品一致, 但阴性样品无SERS信号, 且四种化学成分SERS图谱有明显区别, 说明本法专属性较强, 可以用于化学药物的定性鉴别。

图8

Fig.8

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	图8 模拟阳性样品TLC-SERS图Fig.8 TLC-SERS spectra of simulated positive samples

分别取不同体积的对照品(艾司唑仑)溶液(1, 2, 4, 6, 8和10 μ L)点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上, 相应的沉积量分别为1, 2, 4, 6, 8和10 μ g, 参照1.2.3节实验, 在与最高浓度层析斑点R_f值一致的位置分别做上标记后检测SERS信号。 根据信噪比(S/N=3)判断检测限(LOD), 如图9所示, 艾司唑仑的LOD为4 μ g。 按照此方法分别对其他三种对照品的LOD进行考察, 三唑仑、 氯硝西泮、 奥沙西泮的LOD分别为1, 1和4 μ g, 见图10, 均低于保健食品中可能的添加量。

图9

Fig.9

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	图9 艾司唑仑TLC-SERS检测限考察Fig.9 LOD of estazolam of TLC-SERS

图10

Fig.10

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	图10 不同对照品TLC-SERS检测限考察 a: 三唑仑(1 μ g); b: 艾司唑仑(4 μ g); c: 氯硝西泮(1 μ g); d: 奥沙西泮(4 μ g)Fig.10 LOD of reference substance of TLC-SERS a: Triazolam (1 μ g); b: Estazolam (4 μ g); c: Clonazepam (1 μ g); d: Oxazepam (4 μ g)

因为《中国药典》2015版二部收载的艾司唑仑、 三唑仑、 氯硝西泮、 奥沙西泮口服剂量最小规格分别为1, 0.125, 0.25和15 mg, 故一次服用计量的保健食品中四种化学成分的掺杂量可能分别是1, 0.125, 0.25和15 mg, 按1.2.3节实验, TLC沉积量分别为10, 1.25, 2.5和150 μ g, 均高于相应对照品的的LOD。 故本法可用于检测保健食品中常规掺杂量的化学成分, 具有较高的灵敏度。

将三唑仑、 艾司唑仑、 氯硝西泮、 奥沙西泮四种对照品的拉曼光谱[见图11(a)]与相应TLC-SERS[图11(b)]比较并解析, 每种对照品选择5处以上相对峰强较高的特征峰, 并对其进行特征峰归属, 见表1。

图11

Fig.11

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图11 四种对照品拉曼光谱(a)与TLC-SERS(b) a: 三唑仑; b: 艾司唑仑; c: 氯硝西泮; d: 奥沙西泮Fig.11 Reference conventional Raman spectroscopy (a) and TLC-SERS (b) a: Triazolam; b: Estazolam; c: Clonazepam; d: Oxazepam

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 四种对照品拉曼光谱TLC-SERS特征峰及归属 Table 1 The characteristic peak of four reference substance Raman and TLC-SERS spectra

表1 四种对照品拉曼光谱TLC-SERS特征峰及归属 Table 1 The characteristic peak of four reference substance Raman and TLC-SERS spectra

三唑仑、 艾司唑仑、 氯硝西泮及奥沙西泮均属苯并二氮杂卓类抗焦虑化学合成药, 彼此的拉曼光谱存在明显差异, 但同一成分的拉曼光谱与其 TLC-SERS 存在明显相关性。 例如四种化学物质均存在相同的苯并二氮杂卓环的特征吸收峰分布在1 162~1 170 cm^-1范围内; 氯硝西泮的拉曼光谱及SERS中均有明显的硝基特征峰1 339.26和1 329.69 cm^-1, 可以作为定性分析的指纹信息, 区别结构相近的氯硝西泮与奥沙西泮 ; 三唑仑中甲基的特征峰位移为230.81 cm^-1, 相应SERS位移为240.67 cm^-1, 由此可区别结构非常相近的三唑仑与艾司唑仑。

众所周知, TLC 反映的是目标成分极性或某个官能团的特性, 而上述实验表明拉曼光谱与SERS反映的是目标成分的指纹结构信息, 因此, TLC-SERS联用方法具有很高的专属性。

取不同种样品, 按1.2.3节实验, 得到TLC, 见图12。 样品3和样品5色谱带中出现与三唑仑对照品R_f相近斑点, 疑似添加三唑仑。 由于保健食品体系的复杂性, 仅凭色谱 Rf 相近尚不能准确判定该斑点成分为相应的对照品(三唑仑)。

图12

Fig.12

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	图12 市售样品及对照品TLC检测结果 1— 5: 市售改善睡眠类保健食品样品; 6: 三唑仑; 7: 艾司唑仑; 8: 氯硝西泮; 9: 奥沙西泮Fig.12 TLC of samples and reference substances 1— 5: Improving sleep health-care food samples of market; 6: Triazolam; 7: Estazolam; 8: Clonazepam; 9: Oxazepam

为了进一步鉴别与三唑仑对照品R_f相近斑点, 分别对样品3、 样品5与对照品斑点进行 SERS 检测。 结果显示, 样品3和样品5的SERS信号与三唑仑对照品SERS信号存在明显差异, 见图13。 后经齐齐哈尔市食品药品检验检测中心验证, 样品3与样品5均不含有三唑仑。

图13

Fig.13

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	图13 样品3及样品5 TLC-SERS检测结果 a: 空白银胶溶液; b: 样品3; c: 样品5; d: 三唑仑Fig.13 TLC-SERS of sample 3 and sample 5 a: Blank silver colloid solution; b: Sample 5; c: Sample 3; d: Triazolam

由此可见, TLC-SERS的专属性明显高于仅在UV_{254 nm}项下检视的TLC。

分别对不同批次3号及5号样品TLC斑点进行SERS信号重复性检测, 如图14所示, 同种样品不同批次TLC-SERS峰型基本一致, 个别峰强略有差异, 重复性良好。

图14

Fig.14

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	图14 不同批次样品3及样品5 TLC-SERS检测结果 a, b: 不同批次3号样品; c, d: 不同批次5号样品Fig.14 TLC-SERS of sample 3 and sample 5 of different batches a, b: Sample 3 of different batches; c, d: Sample 5 of different batches